Name: analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי קרני הפעלה מהאוניברסיטה לואיוויל וCA135123 מהמכונים הלאומיים לבריאות (לCH).

1. תא תרבות וTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> COS-7 תאים בתרבית הבינונית של Dulbecco שינוי הנשר (DMEM) בתוספת 4.5 גר &#39;/ הליטר וגלוקוז בסרום שור עוברי (10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transfection פלסמיד נעשה עם Lipofectamine על פי הוראות היצרן (Invitrogen). </li></ol><p class="jove_ti...

<ol>
	<li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+intracellular+protein+transport.">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li><li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion.">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li><li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion.">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs--engines+for+membrane+fusion.">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li><li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREpins:+minimal+machinery+for+membrane+fusion.">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li><li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li><li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs.">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li><li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+(VAMPs)+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception.">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238 (2010).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes.">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li><li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+[see+comments.">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li><li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking.">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li><li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+synaptobrevin/VAMP+homologous+protein+(VAMP5)+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane.">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li><li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells.">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li><li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endobrevin,+a+novel+synaptobrevin/VAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome.">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li></ol>

Assay איחוי התאים המקורי 6 קובע אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן אנו מתארים assay חדשני המכמת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז ומדידת spectrometric. שימוש assay זה, אנו שגרתי לנתח 15-20-V ו-T-Snare שילובים יחיד בניסוי. ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של מגיב וציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7 תאים </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamycin </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> T7765-5mg </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620- </td></tr><tr><td> PBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamine </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> פתרון דיסוציאציה תא אנזים חינם </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> ארנב נוגדן אנטי polyclonal ט repressor </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> אנטי עכבר FITC מצומדות החמור IgG (H + L) </td><td> JacImmunoResearch kson </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> confocal מיקרוסקופ סריקת ליזר </td><td> אולימפוס </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> cytometer הזרימה FACSCalibur </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> מערכת Assay אנזים β-גלקטוזידאז במאגר תמוגה כתב </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> הדגם 100-40 ספקטרופוטומטר UV-VIS </td><td> היטאצ&#39;י </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay

האינטראקציות של מלכודת (גורם oluble N-ethylmaleimide רגיש ceptor מחדש חלבון ttachment ים) חלבונים על שלפוחית ​​(V-מלכודות) ועל קרומי היעד (t-מלכודות) לזרז איחוי שלפוחית ​​תאית 1-4. מבחנים הם חיוניים לכינון מחדש לנתח את מנגנון הוויסות של איחוי המלכודת בתיווך 5. בבדיקת איחוי תאי 6,7, חלבוני מלכודת מתבטאים ectopically בתא השטח. אלה &quot;התהפכו&quot; איחוי כונן מלכודת חלבוני תאי תאים, הוכחה כי מלכודות מספיקות לאיחוי קרום תא. בגלל assay איחוי התאים מתבסס על ניתוח מיקרוסקופי, הוא פחות יעיל כאשר משתמשים בו כדי לנתח מרובה v-ואינטראקציות t-Snare כמותית. כאן אנו מתארים בדיקה חדשה 8 שמכמתת אירועי איחוי תאי מלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז. שניםמרכיבים של מערכת ביטוי גני ט הכבויה 9 משמשים כמערכת readout: טטרציקלין המבוקר transactivator (tta) וכתב פלסמיד שמקודד גן LacZ תחת שליטה של אלמנט טטרציקלין-התגובה (TRE-LacZ). אנו transfect tta לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני v-Snare בתא השטח (V-תאים) וtransfect TRE-LacZ לCOS-7 תאים שהתהפכו מפורשים חלבוני t-Snare בתא השטח (T-תאים) . היתוך מלכודת תלויה של V-והתוצאות מתאי T בכריכה של tta לTRE, הפעלת התעתיק של LacZ והביטוי של β-גלקטוזידאז. הפעילות של β-גלקטוזידאז היא לכמת בשיטת colorimetric על ידי ספיגה ב420 ננומטר. חלבוני קרום שלפוחית ​​הקשורים (VAMPs) הם V-מלכודות שנמצאות בתאים שונים לאחר Golgi שלפוחי 10-15. על ידי בעת 1 VAMPs, 3, 4, 5, 7 ו 8 באותה הרמה, אנו משווים איחויםפעילות באמצעות assay איחוי התאים האנזימטית. מבוסס על מדידת spectrometric, assay זה מציע גישה כמותית לניתוח איחוי מלכודת בתיווך ועל מחקרי תפוקה גבוהה.

לפתח assay איחוי תאי כמותיים, אנו מנצלים את הפעלת השעתוק החזקה על ידי הכריכה של tta לTRE. בהעדר tta, השעתוק של גן LacZ בTRE-LacZ שותק. כאשר tta קיים, הוא נקשר לTRE ומפעיל את השעתוק של LacZ. איור 1 מציג תרשים זרימה של assay איחוי התאים האנזימטית. tta הוא transfected לתוך V-תאים שחלבו...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay at JoVE.com

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

פתחנו assay איחוי תאים שמכמת אירועי איחוי המלכודת בתיווך על ידי ביטוי של β הופעל-גלקטוזידאז.

ניתוח איחוי מלכודת בתיווך באמצעות Assay איחוי תאים אנזימתי

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Anterior Cervical Discectomy and Fusion in the Ovine Model

Discectomy צוואר הרחם Fusion Anterior ו במודל Ovine

Anterior cervical discectomy and fusion (ACDF) is the most common surgical operation for cervical radiculopathy and/or myelopathy in patients who have ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

ייצור חלבוני פיוז'ן IgG המתבטאים באופן ארעי בניקוטיאנה

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

חסימה מיקרוכירורגית של היתוך האשכים בספודופטרה ליטורה

Instead of using genetic methods like RNA interference (RNAi) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated ...