Name: analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00
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यह काम स्टार्टअप धन के द्वारा स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से Louisville और CA135123 के विश्वविद्यालय (CH) से समर्थित है.

1. सेल संस्कृति और प्रोटोकॉल <ol><li> COS-7 कोशिकाओं Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 4.5 ग्राम / एल ग्लूकोज और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक में संवर्धित कर रहे हैं. </li><li> प्लास्मिड अभिकर्मक Lipofectamine साथ निर्माता के निर्द...

<ol>
	<li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+intracellular+protein+transport.">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li><li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion.">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li><li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion.">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs--engines+for+membrane+fusion.">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li><li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREpins:+minimal+machinery+for+membrane+fusion.">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li><li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li><li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs.">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li><li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+(VAMPs)+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception.">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238 (2010).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes.">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li><li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+[see+comments.">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li><li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking.">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li><li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+synaptobrevin/VAMP+homologous+protein+(VAMP5)+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane.">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li><li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells.">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li><li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endobrevin,+a+novel+synaptobrevin/VAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome.">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li></ol>

मूल सेल संलयन 6 परख प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जाल की मध्यस्थता सेल संलयन घटनाओं को निर्धारित करता है. यहाँ हम एक अभिनव परख कि β galactosidase और spectrometric माप सक्रिय अभिव्यक्ति द्वारा जाल की मध्यस्थता स?...

<table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक और उपकरणों के नाम </td><td> कंपनी </td><td> कैटलॉग संख्या </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7 कोशिकाओं </td><td> ATCC </td><td> CRL - १६५१ </td></tr><tr><td> tunicamycin </td><td> सिग्मा Aldrich </td><td> T7765 - 5mg </td></tr><tr><td> PTET ऑफ </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> PBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamine </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> एनजाइम मुक्त सेल हदबंदी समाधान </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> खरगोश विरोधी TET repressor पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC संयुग्मित गधा विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन </td><td> ओलिंप </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur प्रवाह cytometer </td><td> बी.डी. बायोसाइंसेज </td><td></td></tr><tr><td> रिपोर्टर lysis बफर के साथ एनजाइम β Galactosidase परख प्रणाली </td><td> PROMEGA </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> मॉडल 100-40 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर यूवी तुलना </td><td> हितैची </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay

जाल (एस एन ethylmaleimide के प्रति संवेदनशील oluble कारक एक ttachment प्रोटीन फिर नाड़ी का अंतिम सिरा) vesicles (v-snares) पर और लक्ष्य झिल्ली पर प्रोटीन की बातचीत (टी Snares) intracellular पुटिका संलयन 1-4 उत्प्रेरित. पुनर्गठन assays तंत्र और जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन 5 के विनियमन विदारक के लिए आवश्यक हैं. एक सेल संलयन परख में 6,7, जाल प्रोटीन ectopically कोशिका की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं. ये जाल प्रोटीन ड्राइव संलयन सेल सेल &quot;रूप से फ़्लिप&quot;, प्रदर्शन है कि Snares सेलुलर झिल्ली को फ्यूज करने के लिए पर्याप्त हैं. है क्योंकि सेल में विलय परख सूक्ष्म विश्लेषण पर आधारित है, यह कम कुशल है जब कई v-और टी जाल बातचीत मात्रात्मक विश्लेषण किया. यहाँ हम एक नया 8 परख कि β-galactosidase की सक्रिय अभिव्यक्ति जाल की मध्यस्थता सेल संलयन घटनाओं quantifies का वर्णन करता है. दोटेट्रासाइक्लिन नियंत्रित (TTA) transactivator और एक प्लाज्मिड पत्रकार कि टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व के नियंत्रण (TRE lacZ) के तहत lacZ जीन encodes: Tet ऑफ जीन अभिव्यक्ति 9 प्रणाली के घटकों के एक readout प्रणाली के रूप में किया जाता है. क्योंकि 7-कोशिकाओं है कि क्योंकि 7-कोशिकाओं है कि कोशिका की सतह पर व्यक्त टी जाल प्रोटीन रूप से फ़्लिप (टी कोशिकाओं) में व्यक्त v-जाल प्रोटीन कोशिका की सतह पर (v-कोशिकाओं) और TRE lacZ transfect रूप से फ़्लिप में हम transfect TTA . V-और TTA TRE, lacZ के transcriptional सक्रियण और β-galactosidase की अभिव्यक्ति करने के लिए बाध्य में टी कोशिकाओं के परिणामों के संलयन जाल पर निर्भर है. β-galactosidase की गतिविधि absorbance 420 एनएम पर वर्णमिति पद्धति का उपयोग करके मात्रा निर्धारित है. पुटिका से जुड़े झिल्ली प्रोटीन (पिशाचों) v-Snares है कि विभिन्न पद Golgi vesicular डिब्बों में 10-15 रहते हैं. Vamps 1, 3, 4, 5, 7 और 8 में एक ही स्तर पर व्यक्त की, हम उनके झिल्ली संलयन की तुलनागतिविधियों enzymatic सेल संलयन परख का उपयोग कर. Spectrometric माप के आधार पर, इस परख जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन का विश्लेषण करने के लिए और उच्च throughput अध्ययन के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है.

एक मात्रात्मक सेल संलयन परख विकास, हम TTA की TRE के बंधन से मजबूत transcriptional सक्रियण का लाभ ले लो. TTA के अभाव में, TRE lacZ में lacZ जीन का प्रतिलेखन चुप है. जब TTA मौजूद है, यह TRE करने के लिए बांध और lacZ का प्रतिलेखन सक्र?...

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Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

हम एक सेल संलयन परख कि β-galactosidase की सक्रिय अभिव्यक्ति जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन घटनाओं quantifies विकसित किया है.

जाल की मध्यस्थता झिल्ली संलयन के विश्लेषण से एक enzymatic सेल फ्यूजन परख का उपयोग

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

वायरल फ्यूजन कैनेटीक्स के मापन के लिए एकल कण स्तर पर विधि

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Anterior Cervical Discectomy and Fusion in the Ovine Model

पूर्वकाल सरवाइकल और Ovine मॉडल में डिस्केक्टॉमी फ्यूजन

Anterior cervical discectomy and fusion (ACDF) is the most common surgical operation for cervical radiculopathy and/or myelopathy in patients who have ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

COS-7 के फ्लोरोसेंट लेबलिंग लाइव सेल इमेजिंग के लिए तस्वीर टैग फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

एक तेज़, उच्च संकल्प, एमटीपीए GFP-आधारित Mitochondrial फ्यूजन में समानांतर Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग एकाधिक कक्षों की काइनेटिक डेटा हासिल परख

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Murine अस्थि मज्जा में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और मैक्रोफेज

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

एलडीएल कोलेस्ट्रॉल सेल स्वास्थ्य की निगरानी के साथ लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग परख

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

फ्यूजन भागीदारों पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन का प्रभाव खमीर में Polyglutamine विषाक्तता परख का उपयोग

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

मायोब्लास्ट विभेद और फ्यूजन के दौरान नाभिक को ट्रैक करने के लिए लाइव इमेजिंग का दोहन

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

निकोटियाना बेंथामियाना में आईजीजी फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन क्षणिक रूप से व्यक्त किया गया

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

स्पोडोप्टेरा लिटुरा में वृषण संलयन की माइक्रोसर्जिकल बाधा

Instead of using genetic methods like RNA interference (RNAi) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated ...