Name: analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00
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Este trabalho é apoiado por fundos de inicialização da Universidade de Louisville e CA135123 dos Institutos Nacionais de Saúde (para CH).

1. Cultura de Células e Transfecção <ol><li> Células COS-7 foram cultivadas em Meio de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM), suplementado com 4,5 g / l de glucose e 10% de soro fetal bovino (FBS). </li><li> Transfecção de plasmídeo foi feito com Lipofectamina de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). </li></ol> 2. Análise microscópica de fluorescência de células de expressão de superfície SNARE <ol><li> Um dia antes da transfecção, 3 × 10 4 células C...

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	<li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+intracellular+protein+transport.">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li><li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion.">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li><li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion.">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li><li>Jahn, R., Scheller, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endobrevin,+a+novel+synaptobrevin/VAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome.">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li></ol>

O ensaio de fusão de células original, 6 determina SNARE mediadas por eventos de fusão de células por microscopia de fluorescência. Descrevemos aqui um ensaio que quantifica inovador SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase e medição espectrométrica. Utilizando este ensaio, que rotineiramente analisar 15-20 v-e t-SNARE combinações em uma única experiência. Utilizando citometria de fluxo para medir a expressão SNARE na superfície da célula, é ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente e equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> Células COS-7 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5mg </td></tr><tr><td> BRST-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> pBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamina </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzima livre de célula de solução de dissociação </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Coelho anti-TET anticorpo policlonal Repressor </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-conjugado de burro anti-IgG de ratinho (H + L) </td><td> JacImmunoResearch KSON </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Microscópio de varredura a laser confocal </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur citômetro de fluxo </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> β-Galactosidase Sistema de Ensaio Enzima com Tampão de Lise Repórter </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Modelo 100-40 espectrofotómetro de UV-VIS </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay

As interacções dos SNARE (s factor de N-etilmaleimida sensível oluble ttachment um re ceptor de proteína) de proteínas em vesículas (v-SNAREs) e sobre as membranas-alvo (t-SNAREs) catalisam fusão das vesículas intracelulares 1-4. Os ensaios de reconstituição são essenciais para dissecar o mecanismo e regulação de SNARE mediada por fusão de membrana 5. Num ensaio de células de fusão 6,7, proteínas SNARE são expressos ectopicamente na superfície da célula. Estes &quot;invertida&quot; SNARE proteínas unidade de fusão célula-célula, demonstrando que SNAREs são suficientes para fundir as membranas celulares. Uma vez que o ensaio de fusão de células é baseada na análise microscópica, é menos eficaz quando utilizado para a análise múltipla v-e t-SNARE interacções quantitativamente. Descrevemos aqui um novo ensaio que quantifica 8 SNARE mediadas por eventos de fusão de células activado por expressão de β-galactosidase. Doiscomponentes do sistema de expressão do gene Tet-Off 9 são utilizados como um sistema de leitura: o transactivador tetraciclina controlada (tTA) e um plasmídeo repórter que codifica para o gene LacZ sob o controlo do elemento de resposta a tetraciclina (TRE-LacZ). Nós tTA em transfectar células COS-7 que expressam invertidas v-SNARE proteínas na superfície da célula (V-células) e transfectam TRE-LacZ em células COS-7 que expressam invertida t-SNARE proteínas na superfície celular (células T) . SNARE dependente da fusão dos v-e t-células resulta na ligação de tTA a TRE, a activação da transcrição do LacZ e da expressão de β-galactosidase. A actividade de β-galactosidase é quantificado utilizando um método colorimétrico por absorvância a 420 nm. As proteínas de vesículas associadas a membranas (Vamps) são v-SNAREs que residem em várias pós-Golgi compartimentos vesiculares 10-15. Ao expressar Vamps 1, 3, 4, 5, 7 e 8 no mesmo nível, compara-se a sua fusão de membranaactividades utilizando o ensaio enzimático de fusão celular. Com base em medições de espectrometria, este ensaio proporciona uma abordagem para a análise quantitativa SNARE mediada por fusão de membrana e de alto rendimento estudos.

Para desenvolver um ensaio de fusão celular quantitativo, tiramos vantagem da activação transcricional forte pela ligação de tTA a TRE. Na ausência de tTA, a transcrição do gene LacZ em TRE-LacZ é silenciosa. Quando tTA estiver presente, liga-se ao TRE e activa a transcrição de LacZ. Figura 1 mostra um fluxograma do ensaio enzimático das células de fusão. tTA é transfectado em células que v-v-SNARE expressa proteínas na superfície celular, e TRE-LacZ...

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Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Nós desenvolvemos um ensaio de fusão de células que quantifica SNARE mediadas por eventos de fusão da membrana por expressão activada de β-galactosidase.

Análise de SNARE mediada por fusão de membrana usando um ensaio de fusão celular enzimática

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

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