Name: analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00
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Este trabajo es apoyado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Louisville y CA135123 de los Institutos Nacionales de Salud (para CH).

1. Cultivo de células y transfección <ol><li> Células COS-7 se cultivaron en medio Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado con 4,5 g / l de glucosa y 10% de suero fetal bovino (FBS). </li><li> Transfección del plásmido se lleva a cabo con Lipofectamine según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). </li></ol> 2. Análisis de fluorescencia microscópica de la superficie celular Expresión SNARE <ol><li> El día antes de la transfección, 3 × 10 4 células COS-7...

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	<li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+intracellular+protein+transport.">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li><li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion.">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li><li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion.">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li><li>Jahn, R., Scheller, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endobrevin,+a+novel+synaptobrevin/VAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome.">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li></ol>

El ensayo de células fusión original 6 determina mediadas SNARE-eventos de fusión de células mediante microscopía de fluorescencia. Aquí se describe un ensayo que cuantifica innovador SNARE mediada por los acontecimientos de fusión celular activado por la expresión de β-galactosidasa y la medición espectrométrica. Usando este ensayo, se analizan rutinariamente 15 a 20 y v-t-SNARE combinaciones en un solo experimento. Usando citometría de flujo para medir la expresión SNARE en la superficie celula...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de los reactivos y equipos </td><td> Empresa </td><td> El número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7 células </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> pBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofectamina </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzima libre de células solución de disociación </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> De conejo anti-represor Tet anticuerpo policlonal </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-conjugado con burro anti-ratón IgG (H + L) </td><td> JacKson ImmunoResearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> El escaneo láser confocal microscopio </td><td> Olimpo </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur citómetro de flujo </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> β-galactosidasa sistema de ensayo con tampón de lisis reportero </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Modelo 100-40 espectrofotómetro UV-VIS </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay

Las interacciones de las SNARE (s oluble N-etilmaleimida factor sensible a una proteína ttachment ceptor re) proteínas en vesículas (v-SNARE) y en membranas diana (t-SNARE) catalizan la fusión de vesículas intracelulares 1-4. Ensayos de reconstitución son esenciales para disecar el mecanismo y la regulación de la fusión de membranas mediada por 5-SNARE. En un ensayo de fusión celular 6,7, las proteínas SNARE se expresan ectópicamente en la superficie celular. Estos &quot;volteado&quot; SNARE unidad proteínas de fusión célula-célula, lo que demuestra que trampas son suficientes para fusionar las membranas celulares. Debido a que el ensayo de fusión celular se basa en el análisis microscópico, que es menos eficiente cuando se usa para analizar múltiples interacciones y v-t-SNARE cuantitativamente. Aquí se describe un nuevo ensayo que cuantifica 8 SNARE mediada por los acontecimientos de fusión celular activado por la expresión de β-galactosidasa. Doscomponentes del sistema de genes Tet-Off expresión 9 se utiliza como un sistema de lectura: el transactivador controlado por tetraciclina (tTA) y un plásmido informador que codifica el gen LacZ bajo el control del elemento de respuesta de tetraciclina (TRE-LacZ). Nos transfectar tTA en células COS-7 que expresan volteado v-SNARE proteínas en la superficie celular (V-células) y transfección de TRE-LacZ en células COS-7 que expresan volteado t-SNARE proteínas en la superficie celular (células T) . SNARE dependiente de la fusión de la V-y las células T resulta en la unión de tTA a TRE, la activación transcripcional de LacZ y la expresión de β-galactosidasa. La actividad de β-galactosidasa se cuantificó usando un método colorimétrico por absorbancia a 420 nm. Las proteínas asociadas a la membrana de vesículas (vampiros) son v-SNARE que residen en diferentes compartimentos de Golgi post-vesiculares 10-15. Mediante la expresión de VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 y 8 en el mismo nivel, se compara su fusión de membranasactividades utilizando el ensayo de células de fusión enzimática. Sobre la base de la medición espectrométrica, este ensayo ofrece un enfoque cuantitativo para el análisis de SNARE mediada por fusión de membranas y para estudios de alto rendimiento.

Para desarrollar un ensayo de fusión celular cuantitativos, se aprovecha de la fuerte activación transcripcional por la unión de tTA a TRE. En ausencia de tTA, la transcripción del gen LacZ en TRE-LacZ está en silencio. Cuando tTA está presente, se une a la TRE y activa la transcripción de lacZ. Figura 1 muestra un diagrama de flujo de la fusión de células de ensayo enzimático. tTA se transfecta en v-células que expresan v-SNARE proteínas en la superficie celular, ...

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Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Hemos desarrollado un ensayo de fusión celular que cuantifica SNARE mediada por los acontecimientos de fusión de membrana por la expresión activa de β-galactosidasa.

Análisis de la fusión de la membrana SNARE mediada usando un ensayo de fusión celular enzimática

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Investigación

Biología

Anterior Cervical Discectomy and Fusion in the Ovine Model

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Anterior cervical discectomy and fusion (ACDF) is the most common surgical operation for cervical radiculopathy and/or myelopathy in patients who have ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

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Una más rápida, de alta resolución, APMt-GFP-ensayo basado en la fusión mitocondrial Adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

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Ensayo de absorción de colesterol LDL utilizando celular directo imágenes análisis con células control de salud

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

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Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

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