Name: analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Louisville ve CA135123 Üniversitesi (CH) için başlangıç ​​fonları tarafından desteklenmektedir.

1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon <ol><li> COS-7 hücreleri, 4.5 g / l glikoz ve% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde kültürlenmiştir. </li><li> Plazmid transfeksiyon üreticinin talimatlarına (Invitrogen) göre lipofektamin ile yapılır. </li></ol> 2. Hücre Yüzey SNARE İfade Floresan Mikroskobik Analizi <ol><li> Transfeksiyon önceki gün, 3 × 10 4 COS-7 hücreleri 24-kuyucuğu bulunan steril 12-mm cam lamelleri ...

<ol>
	<li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+intracellular+protein+transport.">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li><li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion.">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li><li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion.">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li><li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs--engines+for+membrane+fusion.">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li><li>Weber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREpins:+minimal+machinery+for+membrane+fusion.">SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion.</a> Cell. 92, 759-772 (1998).</li><li>Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+of+cells+by+flipped+SNAREs.">Fusion of cells by flipped SNAREs.</a> Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).</li><li>Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+fusion+by+VAMP3+and+plasma+membrane+t-SNAREs.">Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs.</a> Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).</li><li>Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusogenic+Pairings+of+Vesicle-Associated+Membrane+Proteins+(VAMPs)+and+Plasma+Membrane+t-SNAREs+-+VAMP5+as+the+Exception.">Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception.</a> PloS one. 5, e14238 (2010).</li><li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters.">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li><li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes.">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li><li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+[see+comments.">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li><li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking.">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li><li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+synaptobrevin/VAMP+homologous+protein+(VAMP5)+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane.">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li><li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells.">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li><li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endobrevin,+a+novel+synaptobrevin/VAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome.">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li></ol>

Orijinal hücre füzyon deneyi 6 floresans mikroskobu ile SNARE-aracılı hücre füzyon olayları belirler. Burada β-galaktosidaz ve spektrometrik ölçüm aktive ifadesi ile SNARE-aracılı hücre füzyonu olayların rakamlarla yenilikçi bir tahlil açıklamaktadır. Bu testte kullanarak, rutin analiz 15 - 20 v ve t-SNARE tek bir deneyde kombinasyonları. Hücre yüzeyinde ifade SNARE ölçmek için akış sitometrisi kullanılarak, vamps ifade seviyeleri titre ve membran füzyon kapasiteleri (Şekiller 2...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ve ekipman Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7 hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> tunicamycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> PBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> lipofektamin </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzim-ücretsiz cep disosiasyon çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Tavşan anti-TET Baskılayıcı poliklonal antikor </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-konjuge eşek anti-fare IgG (H + L) </td><td> Jackson Immunoresearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Lazer tarama konfokal mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur flowsitometri </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> Muhabir Lizis Buffer ile β-Galaktosidaz Enzim Assay Sistemi </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Model 100-40 UV-VIS spektrofotometre </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analysis of snare-mediated membrane fusion using an enzymatic cell fusion assay

SNARE (ler oluble N-etilmaleimid duyarlı faktör ttachment proteini yeniden reseptör) veziküller (v-SNARE) ve hedef membranlarda protein etkileşimleri (t-SNARE) intrasellüler vezikül füzyon 1-4 katalize. Sulandırma deneyleri SNARE-aracılı membran füzyon 5 mekanizması ve düzenleme kesme için gereklidir. Bir hücre füzyon deneyi 6,7 olarak, SNARE proteinler hücre yüzeyinde ektopik olarak ifade edilmiştir. Bu SNARE hücre zarının kaynaştırmak için yeterli olduğunu gösteren, SNARE proteinler tahrik hücre-hücre füzyonu &quot;döndürülmüş&quot;. Hücre füzyon deneyi mikroskopik analiz dayandığından çok v-ve t-SNARE etkileşimleri kantitatif analiz için kullanılan zaman, daha az verimlidir. Burada β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı hücre füzyonu olayların rakamlarla, yeni bir tahlil 8 tarif. Ikitetrasiklin kontrollü Transaktivatörü (TTA) ve tetrasiklin yanıt elementinin kontrolü (TRE-lacZ) altında lacZ genini kodlayan bir haberci plazmid: Tet-Off gen ifade sistemi 9 bileşenlerinin bir ölçme sistemi olarak kullanılmaktadır. Ekspres hücre yüzeyinde t-SNARE çevrilen protein COS-7 hücrelerinin (T-hücreleri) içine hücre yüzeyinde v-SNARE proteinleri (v-hücreleri) ile transfekte TRE-lacZ çevrilen COS-7 hücreleri içine transfekte Bu TTA . TRE, lacZ transkripsiyonel aktivasyonu ve β-galaktosidaz ekspresyonu için TTA&#39;nın bağlayıcı olarak V-ve T-hücrelerinin sonuç SNARE-bağımlı füzyon. Β-galaktosidaz aktivitesi 420 nm&#39;de absorbans ile bir kolorimetrik yöntemle ölçülür. Vezikül ilişkili membran proteinleri (vampirler) Çeşitli post-Golgi veziküler bölümlerinde 10-15 ikamet v-SNARE vardır. Aynı seviyede vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve 8 ile ifade, onların membran füzyonu karşılaştırmakenzimatik hücre füzyon deneyi kullanılarak faaliyetleri. Spektrometrik ölçüm dayanarak, bu testte SNARE-aracılı membran füzyon analiz ve yüksek verimlilik çalışmaları için nicel bir yaklaşım sunuyor.

Niceliksel bir hücre füzyon deneyi geliştirmek için, biz TRE TTA bağlama ile güçlü transkripsiyonel aktivasyon yararlanmak. TTA yokluğunda, TRE-lacZ yılında lacZ geninin transkripsiyonu sessizdir. TTA mevcut olduğu zaman, TRE bağlanır ve lacZ geni transkripsiyonunu aktive eder. Şekil 1, bu enzimatik hücre füzyon tahlil oluşan bir akış şeması gösterilmektedir. TTA hücre yüzeyinde ifade v-SNARE proteinler, ve TRE-lacZ T-hücreleri içine transfe...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay at JoVE.com

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.

Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi

The interactions of SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)  proteins on vesicles (v-SNAREs) and on target membranes ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Anterior Cervical Discectomy and Fusion in the Ovine Model

Küçükbaş Model anterior servikal diskektomi ve füzyon

Anterior cervical discectomy and fusion (ACDF) is the most common surgical operation for cervical radiculopathy and/or myelopathy in patients who have ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Canlı Hücre Görüntüleme için SNAP-tag Fusion Proteinler ifade COS-7 Floresan Etiketleme

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL kolesterol alımını tahlil canlı hücre analizi ile hücre Imaging kullanarak sistem durumu izleme

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

Microsurgical Obstruction of Testes Fusion in Spodoptera litura

Spodoptera litura'da Testislerin Füzyonunun Mikrocerrahi Obstrüksiyonu

Instead of using genetic methods like RNA interference (RNAi) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated ...