Name: a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning
Uploaded: 2012-10-30T13:00:00
Duration: 10 min 52 s
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यह काम चिकित्सा अनुसंधान परिषद और मैरी क्यूरी अंतर्राष्ट्रीय Reintegration अनुदान योजना (JKV लिए) द्वारा समर्थित किया गया.

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	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

अभिव्यक्ति क्लोनिंग एक शक्तिशाली उपकरण है कि अतीत में इस्तेमाल किया गया है वायरस रिसेप्टर्स और रक्त सेल प्रतिजनों 12 के रूप में इस तरह के उपन्यास सेलुलर घटकों की पहचान है. यहाँ, हम उपन्यास ख्यात संकेत पारगमन रिसेप्टर्स कि Grb2 करने के लिए बाध्य की पहचान की सुविधा के लिए एक विधि का वर्णन है. प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. <ol><li> स्वचालित प्लाज्मिड तैयारी के लिए यह बिल्कुल जरूरी है बैक्टीरियल गोली का पूरा resuspension है. कभी कभी, यह एक कठोर मिलाते कदम या आगे pipettes साथ मिश्रण शामिल करने के लिए आवश्यक है. </li><li> समाधान 2 और 3 के अलावा होने पर, मिश्रण पूरा आवश्यक है और हमने पाया है कि मैन्युअल inverting सील प्लेट एक स्वचालित हिलनेवाला के उपयोग की तुलना में कुशल है. Pipetting इस कदम पर बचा जाना चाहिए क्योंकि यह डीएनए के कर्तन के लिए नेतृत्व करेंगे. </li><li> सभी वैक्यूम चरणों में, एक करने के लिए सुनिश्चित करें कि तरल पूरी तरह से सूखा हैथाली से. अन्यथा कम पैदावार के लिए उम्मीद की जा रही है. </li><li> क्षालन पर, यह काफी आम है कि प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक प्लाज्मिड बाध्यकारी प्लेट के नीचे रूप बूँदें. इन बूंदों क्षालन थाली में एकत्र होने की जरूरत है, इसलिए यह सिफारिश की है कि प्लाज्मिड बाध्यकारी थाली ध्यान से उठाया है और तल पर किसी भी अवशिष्ट बूँदें ध्यान प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक प्लेट के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. </li><li> अभिकर्मक के दौरान, जटिल गठन के समय महत्वपूर्ण है. हम आम तौर पर 20-30 मिनट के लिए पालन. 1 घंटे के लिए अब बार उपज में कमी के बिना ठीक कर रहे हैं, जबकि छोटे समय सिफारिश नहीं कर रहे. </li><li> माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ाई के चुनाव महत्वपूर्ण है. ओपेरा LX यहाँ प्रणाली का इस्तेमाल किया, 20x पर संकल्प करने के लिए उच्च गुणवत्ता के चित्र मिल पर्याप्त है. यदि उच्च संकल्प छवियों के लिए आवश्यक हैं, उद्देश्य, बदला जा सकता है लेकिन क्रम में कोशिकाओं के सांख्यिकीय महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए, खेतों और उच्च अधिग्रहण बार के एक उच्च संख्या के लिए आवश्यक हैं. सामान्य में, हम उद्देश्यकम से कम 100 कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति imaged मिलता है. </li></ol> Grb2 स्थानान्तरण परख अन्य समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है EGFR kinase सक्रियण 6 के छोटे अणु inhibitors की पहचान. उस मामले में, EGFR ligand प्लाज्मा झिल्ली Grb2 की भर्ती के कारण के साथ विशेष रूप से सक्रिय है. इस बातचीत का विघटन तो छोटे अणु यौगिकों का उपयोग कर जांच की जा सकता है. इसी तरह, यह माना जा सकता है कि siRNA स्क्रीन अंतर्जात EGFR Grb2 संकेतन या सी किट या erythropoietin रिसेप्टर के रूप में अन्य Grb2 बाध्यकारी वृद्धि कारक रिसेप्टर्स में शामिल जीन की पहचान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. इस प्रकार, इस तकनीक के लिए कई संभावित आवेदन कर रहे हैं. एक अनुरूप दृष्टिकोण SHC गपशप, या आईआरएस के रूप में अन्य अनुकूलक अणुओं के लिए GFP टैग संवाददाता सिस्टम लागू किया जा सकता है. स्तनधारी कोशिकाओं में इस सेल आधारित परख का उपयोग करने का एक बड़ा फायदा यह है कि यह physiologically रिलायंस एनर्जी की पहचान सक्षम बनाता हैevant बातचीत. परख प्रोटीन जटिल गठन के लिए एक readout है, लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, प्रासंगिक बातचीत सही उप सेलुलर साइट पर निगरानी कर रहे हैं. इस संबंध में, इस तकनीक को अन्य प्रोटीन, प्रोटीन खमीर दो संकर या इन विट्रो assays में के रूप में ऐसी बातचीत के तरीकों से कलाकृतियों काबू. हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अप्रत्यक्ष बातचीत भी Grb2 भर्ती में परिणाम हो सकता है. इसी तरह, बाध्यकारी भागीदारों के transcriptional विनियमन सीडीएनए अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. इन संभावनाओं के बीच अंतर है, यह उपयुक्त माध्यमिक assays प्रदर्शन करने के लिए प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से बाध्यकारी प्रभाव के बीच भेद करने के लिए आवश्यक है. अंत में, GFP अनुकूलक अणु स्थानान्तरण परख जीनोम चौड़ा स्क्रीनिंग और दवाओं की खोज के अनुप्रयोगों के लिए उच्च क्षमता का वादा किया है.

<table border="1"><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचीपत्र संख्या </td><td> टिप्पणियां (वैकल्पिक) </td></tr><tr><td> सीडीएनए लाइब्रेरी </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> लेग + amp </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> गैस पारगम्य जवानों </td><td> ThermoScientific </td><td> अटल बिहारी 0718 </td><td></td></tr><tr><td> Nucleospin 96 प्लास्मिड किट </td><td> Macherey - Nagel </td><td> 740625.4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> आणविक जांच </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 एफ टीसी </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> हडसन </td><td></td><td> NORGREN CP7200 </td></tr><tr><td> स्वतंत्रता Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> निर्वात कई गुना </td></tr><tr><td> 384 multidrop </td><td> थर्मो </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ओपेरा LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

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A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

सक्षम transmembrane रिसेप्टर्स संकेत उपन्यास की पहचान के लिए एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग पद्धति में वर्णित है. इस पद्धति का बड़े पैमाने पर स्वचालन करने के लिए उत्तरदायी है और के बारे में भविष्यवाणी की अनुमति देता है<em&gt; Vivo में</em&gt; प्रोटीन बाध्यकारी और स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन परिसरों के उप सेलुलर स्थानीयकरण.

एक उच्च सामग्री इमेजिंग कार्यप्रवाह अभिव्यक्ति क्लोनिंग द्वारा अध्ययन Grb2 परिसर संकेत

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Neurotoxicity के उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए एक neuronal और astrocyte सह संस्कृति परख

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

जीन Pulser MXcell electroporation प्रणाली का उपयोग करने के लिए उच्च क्षमता के साथ प्राथमिक कोशिकाओं transfect

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करने के लिए जीन एक्सप्रेशन अध्ययन सरल: आईएल-4 निर्भर जीन एक्सप्रेशन के Namalwa कक्ष में siRNA नॉकडाउन

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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के आयल - एंबेडेड और जमे हुए वर्गों ड्रोसोफिला वयस्क स्नायु

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Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

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