Name: a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning
Uploaded: 2012-10-30T13:00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning at JoVE.com

Эта работа была поддержана Совет по медицинским исследованиям и Марии Кюри Международный реинтеграции Грант схеме (в JKV).

<ol>
	<li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells.">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li><li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr/Abl+and+epidermal+growth+factor+receptor:+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling.">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li><li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor.">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li><li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Feynman+trajectories:+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays.">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li><li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization.">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li><li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators.">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li><li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2.">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li><li>Hertog, J. d. e. n., Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789,+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo.">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li><li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Ash/Grb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain.">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li><li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2.">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li><li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+expression+cloning.">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Выражение клонирования является мощным инструментом, который был использован в прошлом для выявления новых клеточных компонентов, таких как вирусные рецепторы и клетки крови антигенов 12. Здесь мы опишем метод, способствующие установлению новых предполагаемой передачи сигнала рецепторов, которые связываются с Grb2. Есть несколько важных шагов в протоколе. <ol><li> Для автоматизированного плазмидной это абсолютно необходимо иметь полную ресуспендирования бактериальных гранул. Иногда бывает необходимо включить строгий встряхивания шаг или дальнейшее смешивание с пипетки. </li><li> После добавления раствора 2 и 3, полное перемешивание является необходимым и мы обнаружили, что вручную обращения запечатанном пластина является более эффективным, чем использование автоматизированных шейкере. Пипетирование следует избегать этот шаг как это приведет к сдвигу ДНК. </li><li> Во всех вакуумных шаги, нужно убедиться, что жидкость полностью слитаот пластины. В противном случае низких урожаев следует ожидать. </li><li> После элюирования, это довольно часто, что элюата падает форму в нижней части плазмидой обязательные пластины. Эти капли должны быть собраны в элюирования пластины, поэтому его рекомендуется плазмиды обязательного пластина поднимается тщательно и любые остаточные капли на дне тщательно переданы элюата пластины. </li><li> Во время трансфекции, время сложное образование имеет решающее значение. Мы обычно придерживаются 20-30 мин. Более раза до 1 часа прекрасно без снижения урожайности, в то время как более короткое время не рекомендуется. </li><li> Для микроскопии, выбор увеличении важно. О системе Опера LX, используемые здесь, разрешение на 20x является достаточным для получения изображений высокого качества. Если выше разрешение изображения не требуется, цель может быть изменен, но для того, чтобы получить статистически значимые количества клеток, большее число полей и более длительное время приобретения не требуется. В общем, мы стремимсяполучить по крайней мере 100 клеток отображаемого на лунку. </li></ol> Анализ Grb2 транслокация была использована другими группами для определения низкомолекулярных ингибиторов EGFR-киназы из активации 6. В этом случае, EGFR специально активированных лигандом вызывает набор Grb2 к плазматической мембране. Нарушение этого взаимодействия могут быть исследованы с помощью небольшого соединения молекул. Кроме того, он может быть предусмотрено, что миРНК экраны могут быть использованы для выявления эндогенных генов, участвующих в EGFR-Grb2 сигнализации или других Grb2-связывающих рецепторов факторов роста, таких как C-KIT или рецепторов эритропоэтина. Таким образом, существует несколько возможных применений для этой техники. Аналогичный подход может быть применен к GFP с метками систем репортер для других молекул, таких как адаптер Shc, Gab или IRS. Одним из основных преимуществ использования этой ячейки на основе анализа в клетках млекопитающих является то, что она позволяет выявить физиологически отнЕВАНТ взаимодействия. Анализа является отсчета для формирования белкового комплекса, но что еще более важно, соответствующих взаимодействий контролируются при правильном субклеточном сайта. В связи с этим, эта техника преодолевает артефактов из других белок-белковых взаимодействий методы, такие как дрожжи-два-гибридные или в пробирке анализы. Следует отметить, однако, что косвенное взаимодействие может также привести к набору Grb2. Кроме того, до транскрипционной регуляции связывающих партнеров может быть вызвано кДНК выражение. Чтобы различать эти возможности, необходимо выполнить соответствующие вторичные анализы проводить различие между прямым и косвенным обязательным эффектов. В заключение GFP-адаптер молекулы транслокации анализа обещает высокий потенциал для генома скрининга и приложения лекарственных препаратов.

<table border="1"><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии (по желанию) </td></tr><tr><td> Библиотека кДНК </td><td> Origene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LB + усилитель </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Газопроницаемые уплотнений </td><td> ThermoScientific </td><td> AB-0718 </td><td></td></tr><tr><td> NucleoSpin 96 Плазмида Kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625,4 </td><td></td></tr><tr><td> Transfectin </td><td> BioRad </td><td> 170-3351 </td><td></td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Молекулярные зонды </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td> Viewplate 96 F TC </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005182 </td><td></td></tr><tr><td> RapidPick </td><td> Гудзон </td><td></td><td> Norgren CP7200 </td></tr><tr><td> Свобода Evo </td><td> Tecan </td><td></td><td> С вакуумного коллектора </td></tr><tr><td> Multidrop 384 </td><td> Thermo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Опера LX </td><td> PerkinElmer </td><td></td><td></td></tr></table>

a high-content imaging workflow to study grb2 signaling complexes by expression cloning

Передачи сигнала от рецепторов факторов роста имеет важное значение для клеток для поддержания пролиферации и дифференцировке и требует жесткого контроля. Передачи сигнала инициируется связыванием внешних лигандов к рецептору трансмембранного и активации сигнальных каскадов вниз по течению. Ключевым регулятором митогенных сигнализация Grb2, модульные белок, состоящий из внутреннего SH2 (Src гомологии 2) область в окружении двух SH3-доменов, что не хватает ферментативной активности. Grb2 конститутивно связанные с GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) через его N-концевой домен SH3. SH2 области Grb2 связывается с рецепторами фактора роста в фосфорилированные остатки тирозина позволяет сочетать активации рецепторов к SOS-Ras-MAP киназы каскада сигнализации. Кроме того, другие роли Grb2 в качестве положительного или отрицательного регулятора сигнализации и эндоцитоза были описаны. Модульный состав Grb2 предполагает, что это могут располагаться в различных рецепторов и transducэлектронной сигналов по множеству различных путей 1-3. Описанная здесь простая анализа микроскопии, которая контролирует набор Grb2 к плазматической мембране. Это взято из анализа, который измеряет изменения в субклеточном локализации зеленого флуоресцентного белка (GFP)-отмеченном Grb2 в ответ на стимул 4-6. Плазменные мембранные рецепторы, которые связываются Grb2 такие как активированный рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) рекрут GFP-Grb2 в плазматическую мембрану на кДНК выражение, а затем переехать в эндосомного отсеки в клетку. В целях выявления в естественных белковых комплексов из Grb2, этот метод может быть использован для выполнения генома высоким содержанием экрана в зависимости от изменений Grb2 субклеточном локализации. Подготовка клонов кДНК выражения, трансфекции и захвата изображений подробно описаны ниже. По сравнению с другими геномных методов, используемых для идентификации белковых взаимодействий партнеров, таких как дрожжи-два-гипБрод, этот метод позволяет визуализации белковых комплексов в клетках млекопитающих на субклеточном сайт взаимодействия с помощью простого микроскопа на основе анализа. Следовательно, оба качественные характеристики, такие как шаблоны локализации могут быть оценены, а также количественные силу взаимодействия.

Watch this Scientific Journal Video about A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning at JoVE.com

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Высоким содержанием метод скрининга для выявления новых сигнализации компетентные трансмембранных рецепторов описаны. Этот метод поддается крупномасштабной автоматизации и позволяет предсказания о<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Связывающий белок и субклеточном локализации белковых комплексов в клетках млекопитающих.

Высокое содержание изображений Workflow по изучению Grb2 сигнализации комплексы выражением Клонирование

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Нейронов и астроцитов сотрудничеству культуры Пробирной высоких Анализ содержания Нейротоксичность

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Анализ PDZ-зависимый CFTR высокомолекулярных комплексов сигнализации

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Высокая пропускная анализ изображений опухолевых сфероидов: Программное обеспечение удобное приложение для измерения размера сфероидов автоматически и точно

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Измерение скорости обмена веществ в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; С помощью респирометрии

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Workflow для высокого содержания, отдельная клетка количественной флуоресцентных маркеров из Всеобщей микроскоп данных, поддерживаемые ПО с открытым кодом

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Визуализация пространственной реорганизацией МАРК сигнального пути с помощью переходного процесса система экспрессии Tobacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...