Name: in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

ويدعم عمل في مختبر ES من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية. نود أن نشكر الدكتور فوز كونز للحصول على المساعدة مع التصوير.

1. إعداد DNA البلازميد رني لإسكات الجينات الخلوية من نوع محدد البلازميدات (الشكل 1) تم تجميعها باستخدام معيار تقنيات الاستنساخ الجزيئي، كما هو موضح سابقا بالتفصيل 3،4. 1،1 الاستنساخ ف...

<ol>
	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific,+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development.">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).</li><li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo.">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li><li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers.">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li><li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats.">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo.">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).</li><li>Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices.">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li><li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract.">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate,+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III.">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li><li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos.">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments.">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li></ol>

ويمكن استخدام هذه بسيطة، المستندة إلى متجه التعبير ميرنا الاصطناعي استراتيجية في التعبير الجيني الذاتية ضربة قاضية في الأنبوب العصبي الدجاج. هذه الأدوات وظيفية متعددة تقدم إسكات الجينات والتحكم الزمني وخصوصية من نوع الخلية، لتيسير الكشف عن مسارات تنموية معقدة. عل?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> 0.5 مم الزجاج الشعيرات الدموية </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> إبرة الزجاج مجتذب </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard سيليكون المطاط الصناعي </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> سلك التنغستن، 0،075 مم </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> دبابيس الحشرات، 0.20 ملم </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> الحشرات دبابيس، 0.10 ملم </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> ربيع مقص </td><td> غرامة لعلومعملية شريان الحياة </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> دومون # 5 ملقط </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> دومون # 55 ملقط </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> مبادرة ديزرتك الصناعية سريع </td><td> الجزيئية مجسات </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> نيون المجاهر </td><td> OLYMPUS </td><td> SZX12، BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

تم صواري dI1 الخلايا العصبية درس على نطاق واسع لتوضيح الآليات الكامنة والتوجيه محور عصبي خلال 1،2 التنمية. وتقع هذه الخلايا العصبية في النخاع الشوكي الظهري وإرسال محاور عصبية على طول مسارات النمطية. محاور عصبية صواري المشروع في البداية ثم بطنيا نحو عبر floorplate. بعد عبور خط الوسط، وهذه المحاور جعل منعطفا حادا منقاري والمشروع طوليا نحو الدماغ. وينظم كل من هذه الخطوات من قبل العظة من الأنشطة المنسقة جذابة ومثيرة للاشمئزاز التوجيه. التفسير الصحيح لهذه العظة هو أمر حاسم في توجيه محاور عصبية على طول الطريق من ترسيمها. وهكذا، يتم التحقيق بشكل مثالي مساهمة الفسيولوجية للجزيء خاص لتوجيه محور عصبي صواري في سياق الجنين المعيشة. وفقا لذلك، لا بد من ضربة قاضية الجينات في الجسم الحي تسيطر على وجه التحديد من أجل التمييز بعناية أنشطة التوجيه محور عصبي من الجينات التي قد تلعب متعددةالأدوار خلال التنمية. هنا، نحن تصف طريقة لضربة قاضية التعبير الجيني في الأنبوب العصبي الدجاج بطريقة الخلية، اكتب محددة يمكن عزوها. نستخدم ناقلات بلازميد رواية 3 بإيواء الخلايا من نوع محدد المروجين / القدرة التي تدفع التعبير عن بروتين فلوري علامة، يتبعها مباشرة نسخة miR30-رني 4 (تقع داخل UTR-3&#39;من [كدنا] ترميز البروتين الفلورسنت) ( الشكل 1). عندما electroporated في أنبوب للالعصبية النامية، هذه النواقل حصول downregulation كفاءة في التعبير الجيني والتعبير عن البروتينات علامة مشرقة الفلورسنت لتمكين تتبع مباشرة من الخلايا التي تعاني من ضربة قاضية 3. خلط مختلفة ناقلات رني قبل الصعق الكهربائي في وقت واحد يسمح للضربة قاضية من اثنين أو أكثر من الجينات في المناطق المستقلة من الحبل الشوكي. هذه التفاعلات المعقدة يسمح الخلوية والجزيئية للفحص خلال التنمية، على نحو سريع، قimple ودقيقة وغير مكلفة. بالاشتراك مع مبادرة ديزرتك الصناعية تتبع مسارات محور عصبي صواري في كتاب مفتوح التحضيرات 5، هذا الأسلوب هو أداة مفيدة لفي الدراسات المجراة من الآليات الخلوية والجزيئية للنمو محور عصبي صواري والتوجيه. من حيث المبدأ، يمكن أن تستخدم أي مروج / محسن، مما يجعل هذه التقنية يحتمل أكثر قابلية للتطبيق على نطاق واسع لفي الدراسات المجراة من خلال وظيفة الجين التنمية 6. هذا الفيديو يوضح أولا كيف للتعامل مع نافذة والبيض، وحقن البلازميدات الحمض النووي في الأنبوب العصبي وإجراءات الصعق الكهربائي. للتحقيق في صواري التوجيه محور عصبي، تتم إزالة الحبل الشوكي من الجنين باعتباره إعداد كتاب مفتوح، ثابتة، وحقنوا مبادرة ديزرتك الصناعية للتمكين من تتبع مسارات محور عصبي. هي التي شنت الحبل الشوكي بين coverslips وتصور باستخدام المجهر متحد البؤر.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

ووصف الطريقة التي التعبير الجيني في الأنبوب العصبي يمكن أن يكون downregulated بطريقة الخلية، اكتب محددة يمكن عزوها. نحن لشرح كيفية<em&gt; في البيضة</emويمكن استخدام&gt; الصعق الكهربائي من الرنا الميكروي القائم على البلازميدات التي تثير تسيطر spatiotemporally RNA تدخل للتحقيق في صواري التوجيه محور عصبي في أنبوب للالعصبية النامية.

في الصعق الكهربائي من البيضة ميرنا القائم على البلازميدات في أنبوب للتطوير والعصبية تقييم نمط ظاهري من حقن مبادرة ديزرتك الصناعية في الكتاب المفتوح الاستعدادات

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

الجمع بين السلوكية الغدد الصماء والاقتصاد التجريبي : التيستوستيرون والاجتماعي اتخاذ القرار

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

طرق تسجيل متعددة الوحدات لوصف النشاط العصبي في الجراد (<em&gt; الجراد الصحراوي أمريكانا</em&gt;) الدوائر الشم

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

فيفو السابقين الاستعدادات للالميكعي الجهاز سليمة والإكسسوار الشم لمبة

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...