Name: in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

Travail dans le laboratoire de l&#39;ES est soutenu par le Fonds national suisse de la science. Nous tenons à remercier le Dr Beat Kunz de l&#39;aide pour le tournage.

1. Préparation de l&#39;ARNi ADN plasmidique pour Gene Silencing cellulaire spécifique de type Plasmides (figure 1) sont synthétisés en utilisant des techniques de clonage moléculaire, comme décrit précédemment dans le détail 3,4. 1.1 Clonage dans les vecteurs: la conception oligonucelotide <ol><li> Nous utilisons les mêmes oligonucléotides et protocoles universels de clonage qui sont décrits dans l&#39;information produit f...

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	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. 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G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos.">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li><li>Cullen, B. 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Cette simple, basée sur un vecteur d&#39;expression artificielle stratégie miRNA peut être utilisé pour l&#39;expression du gène endogène effet de choc dans le tube neural poulet. Ces outils fonctionnels offrent gene silencing multiple, contrôle temporel et une spécificité de type cellulaire, afin de faciliter l&#39;élucidation des voies de développement complexes. En particulier, nous avons démontré l&#39;utilité de ces plasmides dans le guidage axonal commissurale, depuis les plasmides peuvent être util...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 0,5 mm capillaires en verre </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Verre aiguille extracteur </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporateur </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard élastomère de silicone </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Fil de tungstène, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Broches d&#39;insectes, 0,20 mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Broches d&#39;insectes, 0,10 mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Ciseaux à ressort </td><td> Fin Pour la Scienceols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Rapide Dil </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscopes à fluorescence </td><td> Olympe </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

Commissuraux EL1 neurones ont été étudiés afin d&#39;élucider les mécanismes qui sous-tendent le guidage axonal pendant 1,2 développement. Ces neurones sont situés dans la moelle épinière dorsale et envoient leurs axones le long de trajectoires stéréotypées. Axones commissuraux d&#39;abord projeter vers le ventre, puis à travers la plaque de sol. Après avoir traversé la ligne médiane, ces axones faire un virage serré rostrale et le projet longitudinalement vers le cerveau. Chacune de ces étapes est régie par les activités coordonnées de signaux de guidage attractives et répulsives. L&#39;interprétation correcte de ces signaux est essentielle pour guider les axones le long de leur parcours délimité. Ainsi, la contribution d&#39;une molécule physiologique particulier pour le guidage axonal commissure est idéalement étudiée dans le cadre de l&#39;embryon vivant. En conséquence, inactivation génique in vivo doit être contrôlée avec précision afin de bien distinguer les activités de guidage des axones des gènes qui pourraient jouer multiplerôles au cours du développement. Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;expression des gènes effet de choc dans le tube neural de poulet dans une cellule spécifique du type, de façon traçable. Nous utilisons de nouveaux vecteurs plasmidiques 3 Hébergement cellulaires spécifiques au type de promoteurs / amplificateurs qui alimentent l&#39;expression d&#39;un marqueur fluorescent protein, suivie directement par une transcription miR30-RNAi 4 (situé au sein de la 3&#39;-UTR de l&#39;ADNc codant pour la protéine fluorescente) ( Figure 1). Lorsque électroporation dans le tube neural en développement, ces vecteurs susciter la régulation négative de l&#39;expression génique efficace et d&#39;exprimer vives protéines marqueurs fluorescents pour permettre le traçage directe des cellules qui connaissent knockdown 3. Mélanger différents vecteurs d&#39;ARNi avant l&#39;électroporation permet l&#39;effet de choc simultanée de deux ou plusieurs gènes dans les régions indépendantes de la moelle épinière. Cela permet de complexes interactions cellulaires et moléculaires qui seront examinées au cours du développement, d&#39;une manière qui est rapide, smise, précis et peu coûteux. En combinaison avec Dil tracé des trajectoires des axones dans commissurales à livre ouvert préparations 5, cette méthode est un outil utile pour les études in vivo des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance axonale commissurale et d&#39;orientation. En principe, n&#39;importe quel promoteur / amplificateur peut être utilisé, ce qui pourrait rendre la technique plus largement applicable pour les études in vivo de la fonction des gènes au cours du développement 6. Cette vidéo montre d&#39;abord comment manipuler et oeufs de fenêtres, l&#39;injection de plasmides d&#39;ADN dans le tube neural et la procédure d&#39;électroporation. Pour étudier le guidage axonal commissurale, la moelle épinière est enlevée de l&#39;embryon comme une préparation à livre ouvert, fixé, et injecté avec Dil pour permettre voies axonales à tracer. La moelle épinière est monté entre lamelles et visualisées par microscopie confocale.

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In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Procédé par lequel l&#39;expression du gène dans le tube neural peut être régulée à la baisse dans une cellule spécifique d&#39;un type, est décrit de façon traçable. Nous montrons comment<em&gt; In ovo</emÉlectroporation&gt; des microARN à base de plasmides qui suscitent spatio-temporellement contrôlée ARN interférence peut être utilisée pour étudier le guidage axonal commissurale dans le tube neural développement.

En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l&#39;évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

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Méthodes d&#39;enregistrement multi-unités pour caractériser l&#39;activité neuronale dans le Criquet (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt; Circuits olfactifs)

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