Name: in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

Arbeit im Labor von ES wird durch die Swiss National Science Foundation unterstützt. Wir danken Herrn Dr. Beat Kunz für die Unterstützung bei Dreharbeiten zu danken.

Ein. Vorbereitung der RNAi Plasmid-DNA für Zelltyp-spezifische Gene Silencing Plasmide (Abbildung 1) synthetisiert werden unter Verwendung von Standard molekulare Klonierungstechniken, wie zuvor im Detail beschrieben 3,4. 1,1 Klonierung in den Vektoren: oligonucelotide Design <ol><li> Wir verwenden die gleichen universellen Oligonukleotide und Klonen Protokolle, die in der Produktinformation mit dem pRFPRNAiC vector 4 (ARK-G...

<ol>
	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. 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Diese einfache, vektorbasierten künstlichen miRNA Expressionsstrategie kann Knockdown endogenen Genexpression in dem Neuralrohr Huhn verwendet werden. Diese funktionale Tools bieten mehrere Gen-Silencing, zeitliche Steuerung und Zelltyp-Spezifität, die Aufklärung komplexer Entwicklungsverläufe zu erleichtern. Insbesondere haben wir die Brauchbarkeit dieser Plasmide in kommissuralen Axon Führung gezeigt, da die Plasmide können zur Knockdown verschiedenen Genen in kommissuralen Neuronen oder in ihren Zwischenziel, d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 0,5 mm Glaskapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Glasnadel puller </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard Silikonelastomer </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Wolframdraht, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Insect Pins, 0,20 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Insect Pins, 0,10 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Frühling Schere </td><td> Fine Science Umols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zangen </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 55 Pinzette </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Schnelle DiI </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskopen </td><td> Olymp </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

Kommissuralen dI1 Neuronen wurden ausführlich untersucht, um die zugrunde liegenden Mechanismen Axon Führung während der Entwicklung 1,2 aufzuklären. Diese Neuronen sind im dorsalen Rückenmark und schicken ihre Axone entlang stereotype Bahnen. Kommissuralen Axone zunächst ventral projizieren Richtung und dann über der Bodenplatte. Nach dem Überqueren der Mittellinie, machen diese Axone eine scharfe rostral Turn und Projekt längs zum Gehirn. Jeder dieser Schritte wird durch die koordinierte Tätigkeit der anziehenden und abstoßenden Signalmoleküle reguliert. Die richtige Interpretation dieser Signale ist entscheidend für die Führung von Axonen entlang ihrer abgegrenzten Weg. Somit wird die physiologische Beitrag eines bestimmten Moleküls zu kommissuralen Axon Führung idealerweise im Rahmen des lebenden Embryo untersucht. Dementsprechend müssen Gen knockdown in vivo exakt gesteuert werden, um sorgfältig zu unterscheiden Axon Führung Aktivitäten von Genen, die spielen möglicherweise mehrereRollen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Knockdown Genexpression im Huhn Neuralrohr in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar. Wir verwenden neuartige Plasmidvektoren 3 beherbergen zelltypspezifischen Promotoren / Enhancer, die die Expression eines Fluoreszenzprotein-Marker anzutreiben, direkt gefolgt von einer miR30-RNAi-Transkript 4 (die sich in dem 3&#39;-UTR von der cDNA, die das fluoreszierende Protein) ( Abbildung 1). Wenn in den Entwicklungsbehälter Neuralrohr elektroporiert, hervorzurufen diese Vektoren effiziente Herunterregulation der Genexpression und exprimieren hell fluoreszierenden Marker Proteine ​​ermöglichen die direkte Verfolgung der Zellen erleben Knockdown 3. Mischen verschiedener RNAi-Vektoren vor der Elektroporation erlaubt die gleichzeitige Knockdown von zwei oder mehreren Genen in unabhängigen Bereichen des Rückenmarks. Dies erlaubt komplexen zellulären und molekularen Wechselwirkungen während der Entwicklung untersucht werden, in einer Weise, die schnell, sUmsetzung, präzise und kostengünstig. In Kombination mit DiI Tracing von commissural Axon Trajektorien in Open-book-Präparate 5, ist diese Methode ein nützliches Werkzeug für die in-vivo-Studien der zellulären und molekularen Mechanismen der commissural Axonwachstum und Führung. Im Prinzip könnte jede Promotor / Enhancer verwendet werden, möglicherweise macht die Technik breiter anwendbar für in vivo Studien der Genfunktion während der Entwicklung 6. Dieses Video zeigt, wie zu handhaben und Fenster Eier, die Injektion von DNA-Plasmiden in das Neuralrohr und die Elektroporation Verfahren. Um commissural Axon Führung zu untersuchen, wird das Rückenmark aus dem Embryo als Open-book-Präparation entfernt, fixiert und injiziert mit DiI zu ermöglichen Axon Wege zu verfolgen. Das Rückenmark wird zwischen Deckgläsern montiert und visualisiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie.

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In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Ein Verfahren, durch welches die Genexpression in der Neuralrohr sein herunterreguliert kann in einem Zelltyp-spezifische, nachvollziehbar beschrieben. Wir zeigen, wie<em&gt; In ovo</em&gt; Elektroporation von microRNA-basierte Plasmide, raumzeitlich kontrollierten RNA-Interferenz auslösen kann verwendet werden, um commissural Axon Führung in der Entwicklung von Neuralrohrdefekten zu untersuchen.

In ovo Elektroporation von miRNA-basierte Plasmide in der Entwicklung von Neuralrohr und Beurteilung der Phänotypen von DiI Injection in Open-book Vorbereitungen

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Die Kombination Behavioral Endokrinologie und Experimentelle Wirtschaftsforschung: Testosteron und Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methoden zur neuronalen Aktivität in der Locust Charakterisieren (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktorische Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...