Name: in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

עבודה במעבדה של ES נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע השויצרית. ברצוננו להודות לד&quot;ר Beat קונץ לקבלת סיוע בצילומים.

1. הכנה של ה-DNA פלסמיד RNAi להשתקת גן ספציפית לסוג התא פלסמידים (איור 1) מסונתזים באמצעות טכניקות סטנדרטיות מולקולריות שיבוט, כפי שתוארו בפירוט בעבר 3,4. 1.1 שיבוט לווקטורים: עיצוב oligonucelo...

<ol>
	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific,+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development.">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).</li><li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo.">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li><li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers.">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li><li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats.">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo.">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).</li><li>Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices.">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li><li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract.">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate,+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III.">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li><li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos.">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments.">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li></ol>

אסטרטגיה זו פשוטה, וקטור מבוססת מלאכותית מירנה ביטוי יכולה לשמש לביטוי גני מציאת אנדוגני בצינור העצבי העוף. כלים אלה תפקודיים להציע השתקת גנים מרובות, שליטה זמנית וספציפי תא מסוג, כדי להקל על ההבהרה של מסלולי התפתחות מורכבים. בפרט, אנו הוכחנו את התועלת של פלסמידים אל?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> 0.5 מ&quot;מ זכוכית נימים </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> זכוכית מחט חולץ </td><td> Narishige </td><td> מחשב-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> אלסטומר סיליקון Sylgard </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> תיל טונגסטן, 0.075 מ&quot;מ </td><td> מכשירי Precision העולם </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> סיכות חרקים, 0.20 מ&quot;מ </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> סיכות חרקים, 0.10 מ&quot;מ </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> מספרי האביב </td><td> מדע פיין כדיOLS </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> דומון # 5 מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> דומון # 55 מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> מהר DiI </td><td> בדיקות מולקולריות </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופי פלורסנט </td><td> אולימפוס </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

dI1 נוירונים Commissural נחקרו רב על מנת להבהיר את המנגנונים בבסיס הדרכת האקסון במהלך 1,2 פיתוח. נוירונים אלה ממוקמים בחוט השדרה הגבה ולשלוח האקסונים שלהם לאורך מסלולים סטריאוטיפיים. אקסונים Commissural תחילה להקרין כלפי ventrally ולאחר מכן מעבר לfloorplate. אחרי שחצה את קו האמצע, אקסונים אלה לעשות תפנית חדה ומקורית פרויקט longitudinally לכיוון המוח. כל אחד משלב אלה מוסדר על ידי הפעילות המתואמת של רמזי הדרכה אטרקטיביות ודוחים. הפרשנות הנכונה של הרמזים הללו היא חיונית להדרכה של אקסונים לאורך המסלול המתוחם שלהם. לפיכך, התרומה הפיזיולוגית של מולקולה מסוימת להדרכת האקסון commissural הוא נחקר באופן אידיאלי בהקשר של החיים בהתהוותו. בהתאם לכך, מציאת גן בvivo חייבת להיות נשלטה במדויק כדי להבדיל פעילויות הדרכת האקסון של גנים שעשויים לשחק בזהירות מרובהתפקידים במהלך פיתוח. כאן, אנו מתארים שיטה למציאת ביטוי גנים בצינור העצבי העוף באופן ספציפי לסוג תא, למעקב. אנו משתמשים בוקטורי פלסמיד רומן 3 מטפחים יזמי תאים ספציפיים לסוג / משפרים המניעים את הביטוי של סמן חלבון פלואורסצנטי, ואחרי ישירות על ידי תמליל miR30-RNAi 4 (הממוקם בתוך-UTR 3&#39;של קידוד cDNA חלבון פלואורסצנטי) ( איור 1). כאשר electroporated לתוך הצינור העצבי פיתוח, הווקטורים האלה לעורר downregulation היעיל של ביטוי גנים ולבטא חלבוני סמני ניאון בוהקים כדי לאפשר מעקב ישיר של התאים חווים מציאה 3. ערבוב וקטורי RNAi שונים לפני electroporation מאפשר מציאה סימולטנית של שניים או יותר גנים באזורים עצמאיים של חוט השדרה. זה מאפשר אינטראקציות תאיות ומולקולריות מורכבות לבחינה במהלך פיתוח, באופן שהוא מהיר, שלimple, מדויק וזול. בשילוב עם DiI איתור של מסלולי האקסון commissural בהכנות של ספרים פתוחים 5, שיטה זו היא כלי שימושי עבור במחקרי vivo של מנגנונים התאיים ומולקולריים של צמיחת האקסון commissural והדרכה. בעיקרון, כל אמרגן / משפר יכול לשמש, באופן פוטנציאלי ביצוע הטכניקה מתאימה יותר נרחבת במחקרי vivo של תפקוד גן במהלך 6 פיתוח. סרטון זה מדגים ראשון כיצד לטפל וביצים של חלונות, ההזרקה של פלסמידים DNA לתוך הצינור העצבי והליך electroporation. כדי לחקור הדרכת האקסון commissural, חוט השדרה הוא להסיר את העובר כהכנת ספר פתוח, קבוע, והוזרק לי DiI לאפשר מסלולי האקסון לנודעו עקבותיו. חוט השדרה הוא רכוב בין coverslips ודמיין באמצעות מיקרוסקופ confocal.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

שיטה שבאמצעותה ביטוי גנים בצינור העצבי יכול להיות downregulated באופן ספציפי לסוג תא, מעקב מתוארת. אנחנו מדגימים איך<em&gt; באוב</em&gt; Electroporation של פלסמידים microRNA מבוססים שיעוררו התערבות RNA spatiotemporally מבוקרת יכול לשמש כדי לחקור הדרכת האקסון commissural בצינור העצבי פיתוח.

בelectroporation אובו של פלסמידים מירנה מבוססים ברכבת התחתית הפיתוח העצבי והערכת פנוטיפים ידי הזרקת DiI בהכנות-ספר פתוח

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

שילוב של התנהגות אנדוקרינולוגיה וכלכלה ניסויית: החלטת טסטוסטרון חברתית ביצוע

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...