Name: in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

Il lavoro nel laboratorio di ES è supportato dal Fondo nazionale svizzero della scienza. Vorremmo ringraziare il Dr. Beat Kunz per l&#39;assistenza con le riprese.

1. Preparazione di DNA plasmidico RNAi per Cell Type-specifico silenziamento genico Plasmidi (Figura 1) sono sintetizzati usando tecniche standard di clonazione molecolare, come precedentemente descritto in dettaglio 3,4. 1,1 clonazione nei vettori: design oligonucelotide <ol><li> Usiamo gli stessi oligonucleotidi universali e protocolli clonazione che sono descritti nelle informazioni sul prodotto fornite con il vettore pRFPRNAiC ...

<ol>
	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. 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Questo semplice, vettoriale artificiale strategia miRNA può essere utilizzato per l&#39;espressione del gene endogeno knockdown nel tubo neurale pollo. Questi strumenti funzionali offrono silenziamento genico multipla, il controllo temporale del tipo cellulare e specificità, per facilitare la spiegazione dei complessi percorsi di sviluppo. In particolare, abbiamo dimostrato l&#39;utilità di questi plasmidi nell&#39;orientamento dell&#39;assone commissurali, poiché i plasmidi possono essere utilizzati per atterrament...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 0,5 millimetri capillari di vetro </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Vetro ago estrattore </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Elettroporatore </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard silicone elastomero </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Tungsteno filo, 0,075 millimetri </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Perni insetti, 0,20 millimetri </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Perni insetti, 0,10 millimetri </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Primavera forbici </td><td> Scienza Belle Perols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forcipe </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont N ° 55 pinze </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Veloce DiI </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscopi a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

Commissurali DI1 neuroni sono stati ampiamente studiati per chiarire i meccanismi alla base di orientamento degli assoni durante 1,2 sviluppo. Questi neuroni sono situati nel midollo spinale dorsale e inviare loro assoni lungo traiettorie stereotipati. Assoni commissurali inizialmente proiettare ventralmente verso e poi in tutto il fondello. Dopo aver attraversato la linea mediana, questi assoni compiere una brusca virata rostrale e progetto longitudinalmente verso il cervello. Ciascuna di queste fasi è regolata dalle attività coordinate di spunti di orientamento attrattive e repulsive. La corretta interpretazione di questi segnali è fondamentale per la guida degli assoni lungo il loro percorso delimitata. Pertanto, il contributo fisiologica di una particolare molecola di guida assonale commissurali è idealmente esaminati nel contesto dell&#39;embrione vivente. Pertanto, knockdown gene in vivo devono essere controllati con precisione per distinguere attentamente attività di orientamento assone di geni che possono svolgere moltepliciruoli durante lo sviluppo. Qui, si descrive un metodo per l&#39;espressione del gene knockdown nel tubo neurale pollo in una cella di tipo-specifico, modo tracciabile. Usiamo nuovi vettori plasmidici 3 harboring cellule tipo-specifici promotori / enhancer che guidano l&#39;espressione di una proteina marker fluorescente, seguito direttamente dal miR30-RNAi trascrizione 4 (situato all&#39;interno del 3&#39;-UTR del cDNA che codifica la proteina fluorescente) ( la figura 1). Quando elettroporati nel tubo neurale in via di sviluppo, questi vettori suscitare sottoregolazione efficace di espressione genica e di esprimere proteine ​​marker luminosi fluorescenti per attivare l&#39;analisi diretta delle cellule vivendo knockdown 3. Mescolando diversi vettori RNAi prima elettroporazione permette knockdown simultanea di due o più geni indipendenti in regioni del midollo spinale. Questo consente complesse interazioni cellulari e molecolari da esaminare durante lo sviluppo, in un modo che è veloce, sattua, preciso ed economico. In combinazione con DiI tracciamento delle traiettorie assoni commissurali in open-book preparati 5, questo metodo è un utile strumento per studi in vivo dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni commissurali e di orientamento. In linea di principio, qualsiasi promotore / enhancer potrebbe essere utilizzato, rendendo potenzialmente la tecnica più ampiamente applicabile per studi in vivo della funzione del gene durante lo sviluppo 6. Questo video mostra prima come gestire e uova finestra, l&#39;iniezione di plasmidi di DNA nel tubo neurale e la procedura di elettroporazione. Per studiare la guida commissurali dell&#39;assone, il midollo spinale viene rimosso dall&#39;embrione come un libro aperto di preparazione, fissato, e iniettato con DiI per consentire percorsi assoni da tracciare. Il midollo spinale è montata tra coprioggetto e visualizzati usando la microscopia confocale.

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In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Un metodo di espressione genica nel tubo neurale può essere downregulated in una cella di tipo-specifico, tracciabile modo descritto. Noi dimostrare come<em&gt; In ovo</emElettroporazione&gt; di microRNA basati plasmidi che suscitano spatiotemporally controllato interferenza RNA può essere usato per studiare commissurali guida assonale nel tubo sviluppo neurale.

In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

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In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

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