Name: in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

Arbete i labbet av ES stöds av den schweiziska National Science Foundation. Vi vill tacka Dr Vispa Kunz för hjälp med filmning.

1. Beredning av RNAi plasmid-DNA för Cell typspecifika geners uttryck Plasmider (figur 1) syntetiseras med användning av standardtekniker molekylära kloningstekniker, såsom tidigare beskrivits i detalj 3,4. 1,1 Kloning in i vektorerna: oligonucelotide konstruktion <ol><li> Vi använder samma universella oligonukleotider och protokoll kloning som beskrivs i produktinformationen som följer med pRFPRNAiC vektorn 4 (ARK-Geno...

<ol>
	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific,+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development.">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).</li><li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo.">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li><li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers.">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li><li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats.">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo.">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).</li><li>Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices.">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li><li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract.">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate,+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III.">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li><li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos.">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments.">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li></ol>

Denna enkla, vektor-baserad artificiell miRNA expression strategi kan användas för att ÖVERVÄLDIGANDE endogen genexpression i kyckling neuralröret. Dessa funktionella verktyg erbjuder flera geners uttryck, temporal kontroll och celltyp specificitet, för att underlätta klargörande av komplexa utvecklingsbanor. Framför allt har vi visat nyttan av dessa plasmider i kommissurala axon vägledning, eftersom plasmider kan användas för att knockdown distinkta gener i kommissurala neuroner eller i mellanliggande mål,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> 0,5 mm glaskapillärer </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Glasnål avdragare </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Elektroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard silikonelastomer </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Volframtråd, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Insect stift, 0,20 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-20 </td></tr><tr><td> Insect stift, 0,10 mm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-10 </td></tr><tr><td> Spring sax </td><td> Fin vetenskap tilloler </td><td> 15.003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pincett </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 pincett </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.255-20 </td></tr><tr><td> Snabb Dil </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Fluorescerande mikroskop </td><td> Olympus </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

Kommissurala DI1 nervceller har studerats utförligt för att belysa mekanismerna bakom axon vägledning under utveckling 1,2. Dessa nervceller finns i den dorsala ryggmärgen och skicka sina axoner längs stereotypa banor. Kommissurala axoner ursprungliga projektet ventralt mot och sedan över floorplate. Efter att ha korsat mittlinjen, dessa axoner gör en skarp rostralt sväng och projekt longitudinellt mot hjärnan. Vart och ett av dessa steg regleras de samordnade insatserna av attraktiva och frånstötande vägledning ledtrådar. Den korrekta tolkningen av dessa ledtrådar är avgörande för vägledning av axoner längs sin avgränsade väg. Sålunda, är den fysiologiska bidrag av en speciell molekyl till kommissurala axon vägledning idealiskt undersöktes i samband med levande embryo. Därför måste gen ÖVERVÄLDIGANDE in vivo styras exakt för att noga skilja axon handledning av gener som kan spela fleraroller under utvecklingen. Här beskriver vi en metod för att knockdown genuttryck i kyckling neuralröret i en celltyp-specifik, spårbart sätt. Vi använder nya plasmidvektorer 3 härbärgerande cell typ-specifika promotorer / förstärkare som driver uttrycket av ett fluorescerande protein markör, följt direkt av en miR30-RNAi transkript 4 (belägen inuti 3&#39;-UTR av den cDNA som kodar det fluorescerande proteinet) ( Figur 1). När elektroporerades in utvecklingsländerna neuralröret, dessa vektorer framkallar effektiv nedreglering av genuttryck och uttrycka ljusa fluorescerande markörproteiner att möjliggöra direkt spåra celler upplever knockdown 3. Blanda olika RNAi vektorer före elektroporering möjliggör samtidig ÖVERVÄLDIGANDE av två eller flera gener i oberoende regioner av ryggmärgen. Detta möjliggör komplexa cellulära och molekylära interaktioner som skall undersökas under utveckling, på ett sätt som är snabb, sgenomföra, exakt och billigt. I kombination med Dil spårning av kommissurala axon banor i öppna bok förberedelser 5, är denna metod ett användbart verktyg för in vivo-studier av cellulära och molekylära mekanismer för kommissurala axon tillväxt och vägledning. I princip kan vilken som helst promotor / förstärkare kan användas, eventuellt gör tekniken mer allmänt tillämplig för in vivo studier av genfunktion vid utveckling 6. Denna video demonstrerar först hur att hantera och ägg fönster, injektion av DNA plasmider i neuralröret och elektroporering proceduren. För att undersöka kommissurala axon vägledning är ryggmärgen avlägsnas från embryot som en öppen bok förberedelser, fasta och injiceras med Dil för att axon vägar kan spåras. Ryggmärgen monteras mellan täckglas och visualiseras med hjälp konfokalmikroskopi.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

En metod genom vilken genexpression i neuralröret kan vara nedreglerade i en celltyp-specifik, spårbart sätt beskrivs. Vi visar hur<em&gt; In ovo</em&gt; Elektroporering av mikroRNA-baserade plasmider som framkallar spatiotemporally styrd RNA-interferens kan användas för att undersöka kommissurala axonet vägledning i utvecklingsländerna neuralröret.

In ovo Elektroporering av miRNA-baserade plasmider i utvecklingsländer neuralröret och bedömning av fenotyper av Dil injektion i öppen bok Förberedelser

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Kombinera Behavioral Endokrinologi och experimentell ekonomi: Testosteron och sociala beslutsfattande

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo elektroporering av utvecklingsländer Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Genöverföring till utvecklingsländerna Mouse innerörat genom<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporering

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utbyggnad av embryonala och vuxna neurala stamceller genom<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaxisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Multi-enhet inspelning Metoder för att karaktärisera neural aktivitet i Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactory kretsar

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genmanipulation av Mouse Utveckla Hypothalamus genom<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporering

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...