Name: in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

ES laboratuarında Çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından destekleniyor. Biz filme yardım için Dr bitirin Kunz teşekkür etmek istiyorum.

1. Hücre tipine özgü gen susturma için RNAi Plazmit DNA&#39;nın hazırlanması Plazmidler (Şekil 1), daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı 3,4 standart moleküler klonlama teknikleri kullanılarak sentez edilir. Vektörlere 1.1 Klon: oligonucelotide tasarım <ol><li> Aynı evrensel oligonükleotidler ve pRFPRNAiC vektör 4 (ARK-Genomik) ile sağlanan ürün bilgileri de tarif edilmiştir klonlama protokoller k...

<ol>
	<li>Ch&#233;dotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+tales+of+the+midline.">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li><li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1.">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21 (2009).</li><li>Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific,+traceable+gene+silencing+for+functional+gene+analysis+during+vertebrate+neural+development.">Cell type specific, traceable gene silencing for functional gene analysis during vertebrate neural development.</a> Nucleic Acids Research. 39, e133 (2011).</li><li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo.">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li><li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers.">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li><li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats.">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo.">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071 (2010).</li><li>Kim, B. G., Dai, H. -. N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices.">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li><li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract.">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li><li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system.">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li><li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate,+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III.">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li><li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos.">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li><li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function.">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments.">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li></ol>

Bu basit, vektör tabanlı bir yapay stratejinin miRNA ifade tavuk nöral tüp içinde devirme endojen gen ekspresyonu için kullanılabilir. Bu fonksiyonel araçlar karmaşık bir gelişimsel yolların aydınlatılmasında kolaylaştırmak için, birden fazla gen susturulması, zamansal kontrolü ve hücre tipi özgüllük sunuyoruz. Plazmitler commissural nöronlar ya da kendi ara hedef, zemin plakası 3 devirme gen için kullanılır dolayısıyla ayrıntılı olarak,, commissural akson yönlendirme, bu pl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 0,5 mm cam kapilerleri </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Cam iğne çektirme </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Elektroporatör </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard silikon elastomer </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Tungsten tel, 0.075 mm </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Böcek iğne, 0,20 mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Böcek iğne, 0,10 mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Bahar makas </td><td> Için Güzel Bilimols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Hızlı DII </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Floresan mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation of mirna-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by dii injection in open-book preparations

Commissural DI1 nöronlar yoğun gelişim 1,2 sırasında akson rehberliği altında yatan mekanizmaları aydınlatmak çalışılmıştır. Bu nöronlar dorsal omurilikte bulunan ve basmakalıp yörüngeleri boyunca aksonları gönderebilirsiniz. Commissural akson başlangıçta yönünde ve daha sonra zemin plakası üzerinde ventral proje. Midline geçtikten sonra, bu aksonlar uzunlamasına beyin doğru keskin bir dönüş rostral ve proje yapmak. Bu adımların her biri çekici ve itici rehberlik ipuçlarının koordineli faaliyetler düzenlenir. Bu ipuçlarının doğru yorumlanmasını kendi sınırları çizilmiş yol boyunca akson rehberlik için çok önemlidir. Böylece, kılavuz commissural akson için belirli bir molekülün fizyolojik katkı ideal olarak canlı embriyo bağlamında incelenmiştir. Buna göre, in vivo gen demonte hassas dikkatle birden oynayabilir genlerin akson rehberlik faaliyetleri ayırt etmek için kontrol edilmelidirgelişimi sırasında rolleri. Burada, bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde tavuk nöral tüp knockdown gen ekspresyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz 3 hücre tipine özgü yararlanıcı / Bir floresan protein marker ekspresyonu sürücü arttırıcılar, barındıran bir miR30-RNAi transkript 4 (cDNA floresan protein 3&#39;-UTR içinde bulunan) (tarafından doğrudan takip roman plazmid vektörler kullanın Şekil 1). Gelişmekte olan nöral tüp içine electroporated, bu vektörlerin gen ifadesinin verimli baskılanması ortaya çıkarmak ve demonte 3 karşılaştığınız hücrelerin izleme doğrudan etkinleştirmek için parlak floresan işaretleyici proteinleri ifade. Elektroporasyon önce farklı RNAi vektörler Karıştırma omurilik bağımsız bölgelerinde iki ya da daha fazla genin eşzamanlı devirme izin verir. Bu hızlı bir şekilde, s, geliştirme aşamasında ele alınacak kompleks hücresel ve moleküler etkileşimler izin, uygu hassas ve ucuz. Açık kitap hazırlıkları 5 commissural akson yörünge Dii izleme ile birlikte, bu yöntem commissural akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmalar in vivo çalışmalar için yararlı bir araçtır. Ilke olarak, herhangi bir hızlandıncı / kuvvetlendirici potansiyel olarak geliştirme 6 sırasında gen fonksiyonu in vivo çalışmaları için yöntem daha geniş çapta uygulanabilir hale kullanılabilir. Bu video ilk nasıl işleneceğini gösterir ve pencere yumurta, nöral tüp içine DNA plazmid enjeksiyon ve elektroporasyon prosedürü. Commissural akson rehberlik araştırmak için, spinal kord, açık-kitap hazırlanması gibi embriyo kaldırılır sabit ve akson yollar izlenebilir sağlamak için Dii ile enjekte edilir. Omurilik lamelleri arasına monte ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlandırılmaya çalışılır.

Watch this Scientific Journal Video about In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations at JoVE.c

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Nöral tüp içinde gen ekspresyonunu bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde aşağı regüle olabilen göre bir yöntem tarif edilmektedir. Biz nasıl gösterilmektedir<em&gt; Ovo</emSpatiotemporally kontrollü bir RNA girişim ortaya microRNA tabanlı bir plazmid&gt; elektroporasyon gelişen nöral tüp içinde commissural akson kılavuz araştırmak için kullanılabilir.

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Davranış Endokrinoloji ve Deneysel İktisat birleştiren: Testosteron ve Sosyal Karar Verme

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Gelişmekte olan Zebra balığı önbeyin klonal olarak ilişkilidir Sinir Progenitör Hücreler Zaman atlamalı Canlı Görüntüleme

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...