Name: rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور ستيفن Kingsmore والطب الجينوم مركز طب الأطفال في مستشفيات الرحمة للأطفال وعيادات لاستخدام مجموعات الحوسبة من أجل تحليل البيانات المتوفرة لدينا، البورشيد لفريق الخدمة الميدانية (اليزابيث بوير، كوك سكوت وكوك مارك) والتقنية فريق استشاري لردودها سريعة ومقترحات مفيدة على التوالي الصك الجيل القادم التسلسل DNA، HiScanSQ، وتحليل البيانات النوعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HL080042 (لSQY) وبدء صندوق الوقف للمستشفيات والرحمة للأطفال وعيادات. جامعة ميسوري في مدينة كنساس (لSQY)

<html> يتم عرض مخطط يحدد هذا البروتوكول في الشكل 1. 1. علاج الخلايا مع الثرومبين، RNA العزلة، وتقييم جودة الكمي لRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الخلايا البطانية الإنسان (...

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data.">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li><li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

الخطوات الرئيسية التعامل مع RNA: RNases سوف تتحلل حتى أكثر عالية الجودة RNA، لذلك يجب توخي الحذر خلال العزلة، تخزين واستخدام RNA 10. يتم ارتداؤها دائما قفازات لمنع التلوث من RNases العثور على الأيدي البشرية. يجب تغيير القفازات ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td width="183"> الكواشف أو معدات </td><td width="85"> شركة </td><td width="185"> كتالوج رقم </td><td width="359"> تعليقات </td></tr><tr><td> خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الإنسان غشائي </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza، كيت رصاصة </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> يحتوي EGM-2، FBS، عوامل النمو والمضادات الحيوية </td></tr><tr><td> ثرومبين </td><td> سيجما </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion مير فانا كيت </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 1560 AM </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز-زاب </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> بيو راد </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA إعدادعدة </td><td> البورشيد </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> الخرز AMPureXP </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> مرتفع عكس المنتسخة II </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA 1K </td><td> بيو راد </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> QIAGEN </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE الكتلة الجيل كيت </td><td> البورشيد </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX التحكم كيت </td><td> البورشيد </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 دورة SBS كيت </td><td> البورشيد </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> البورشيد </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> البورشيد </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR آلة - Viia7 </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> نموذج # VIIA7 / 10631261 # المعدات </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> Experion نظام </td><td> راد الحيوي </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer هو نظام بديل </td></tr><tr><td> الطيف </td><td> الحيوي تك </td><td> عصر صفيحة ميكروسكوبية الطيف </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> الطرد المركزي - الكتب التي أسطورة XTR </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 75004521 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> موقف المغناطيسي </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-جيدا thermocycler </td><td> مختبر مزود العامة </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 3. قائمة الكواشف الرئيسية وE الرئيسيةquipment. *، وفي شريط الفيديو، وقد تجلى HiSeq1000 بدلا من HiScanSQ. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

توصيف التعبير الجيني في الخلايا عن طريق قياس مستويات مرنا هو أداة مفيدة في تحديد كيفية تأثر الجهاز النسخي للخلية بواسطة إشارات خارجية (على سبيل المثال العلاج من تعاطي المخدرات)، أو كيف تختلف الخلايا بين حالة صحية ودولة مريضة. مع ظهور والتحسين المتواصل لتكنولوجيا DNA الجيل القادم التسلسل، أصبح RNA-التسلسل (RNA-يليها) وسيلة شعبية متزايدة لتحليل transcriptome الى الدليل كافة أنواع النصوص، لتحديد هيكل الترانسكربتي من جميع الجينات التي أعرب عنها وتحديد ل مستويات التعبير المتغيرة للمجموعة مجموع النصوص في الخلية 1،2، أو الأنسجة كائن معين. RNA-يليها إلى تغييره بالتدريج ميكروأرس DNA كأسلوب مفضل للتحليل transcriptome لأنه يحتوي على مزايا أنشأ حسابا باسم transcriptome كاملة، وتوفير نوع مسند الرقمية (عدد نسخة من أي نص) وليس الاعتماد على أي sequen الجيني المعروفةم 3. هنا، نقدم بروتوكول كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. ويستند هذا البروتوكول على دراسة حديثة نشرت لدينا بعنوان &quot;RNA-يليها يكشف Transcriptome الرواية الجينات والأشكال الإسوية خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الإنسان الرئوي غشائي المعالجة مع الثرومبين،&quot; 4 التي نفذنا بنجاح أول تحليل transcriptome كاملة من خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية تعامل مع الثرومبين باستخدام RNA-يليها. أسفرت موارد تكنولوجيا المعلومات لم يسبق لها مثيل لمزيد من التجارب للحصول على أفكار في الآليات الجزيئية الكامنة ثرومبين بوساطة ضعف البطانية في التسبب في حالات الالتهابات، والسرطان، والسكري، وأمراض القلب التاجية، ويوفر إمكانية خيوط جديدة الأهداف العلاجية لتلك الأمراض. النص الوصفي من هذا البروتوكولوينقسم إلى أربعة أجزاء. الجزء الأول يصف العلاج للخلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع الثرومبين والعزلة RNA، والتحليل الكمي والجودة. الجزء الثاني يصف بناء مكتبة والتسلسل. الجزء الثالث ويصف تحليل البيانات. الجزء الرابع يصف مقايسة التحقق من صحة RT-PCR. يتم عرض نتائج ممثلة من الخطوات الرئيسية عدة. وتقدم نصائح مفيدة لتعزيز الاحتياطات أو النجاح في الخطوات الرئيسية في قسم المناقشات. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم الرئوي الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الخلايا البطانية تعامل مع الثرومبين، يمكن أن يكون تعميمها على transcriptomes الشخصي في كل من خلايا الثدييات وغير الثدييات والأنسجة في التعامل مع محفزات مختلفة أو مثبطات، أو لمقارنة transcriptomes في الخلايا أو الأنسجة بين حالة صحية ودولة المرض.

لخطوة 1: 28S: يستخدم تقليديا 18S نسبة كمؤشر على تدهور RNA. ومن الناحية المثالية، ذروة 28S يجب أن يكون حوالي ضعف مساحة الفرقة 18S (نسبة 2)، ولكن هذا في كثير من الأحيان لا ينظر النسبة المثالية من الناحية العملية. وعلاوة على ذلك، 28S: يمكن الحصول عليها من نسب 18S طرق طيفية نقل?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

ويعرض هذا البروتوكول إجراء كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها، قوية تكنولوجيا الحمض النووي من الجيل التالي تسلسل، لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. هذا البروتوكول هو تعميم لمختلف الخلايا أو الأنسجة المتضررة من الكواشف المختلفة أو الحالات المرضية.

RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

الهندسة الحيوية شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان في الفئران العوز المناعي

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

في دراسة فيفو من تفاعل الانسان غشائي-خلية حوطية باستخدام مصفوفة جل التوصيل الفحص في الماوس

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...