Name: rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. Stephen Kingsmore og Pediatric Genome Medicine Center på Børns Mercy Hospitaler og klinikker for brugen af ​​deres computing klynger for vores dataanalyse, Illumina mark service team (Elizabeth Boyer, Scott Cook og Mark Cook) og teknisk konsulent team for deres hurtige svar og nyttige forslag om driften af ​​den næste generation DNA-sekventering instrument, HiScanSQ, og datakvalitet analyse. Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health Grant HL080042 (til SQY) og opstart fond og begavelse af Børns Mercy Hospitaler og klinikker, University of Missouri i Kansas City (til SQY).

<html> Et rutediagram der beskriver denne protokol er vist i figur 1.. 1. Behandling af celler med thrombin, RNA Isolation, kvalitetsvurdering og Kvantificering af RNA <ol><li> Kultur humane lunge mikrovaskulære endotelceller (HMVEC-LBL) til 90-100% konfluens i plader med 6 brønde i EGM-2 medium med 5% FBS, vækstfaktorer og antibiotika (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Skifte medie til udsultningsmedier (0% FBS) 30 min før behandling med thrombin. </li><li> Behandle celler...

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data.">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li><li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

Vigtige skridt RNA Håndtering: RNaser vil forringe selv de mest høj kvalitet RNA, derfor skal man være omhyggelig under isoleringen, opbevaring og anvendelse af RNA 10. Handsker er altid slidt for at forhindre forurening af RNaser fundet på menneskehænder. Handsker skal udskiftes ofte, især efter at røre huden, dørhåndtag eller andre almindelige overflader. Et sæt af pipetter bør være dedikeret udelukkende til RNA arbejde og alle tips og rør skal være R...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Reagenser eller udstyr </td><td width="85"> Firma </td><td width="185"> Katalog nummer </td><td width="359"> Kommentarer </td></tr><tr><td> Humane lunge mikrovaskulære endotelceller </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Bullet Kit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> Indeholder EGM-2, FBS, vækstfaktorer og antibiotika </td></tr><tr><td> Thrombin </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA-fremstillingKit </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP Beads </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript Reverse Transcriptase II </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204.163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster Generation Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Kontrol Kit </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Cycle SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR maskine - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Model # VIIA7 / Udstyr # 10.631.261 </td><td> Eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Experion System </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer er et alternativt system </td></tr><tr><td> Spektrofotometer </td><td> Bio-Tek </td><td> Epoch Microplate Spectrophotometer </td><td> Eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Centrifuge - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Eller tilsvarende </td></tr><tr><td> Magnetisk fod </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-brønds thermocycler </td><td> General Lab Leverandør </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 3. Liste over nøglereagenser og Major Equipment. * I videoen blev HiSeq1000 stedet for HiScanSQ demonstreret. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

Karakteriseringen af genekspression i celler via måling af mRNA-niveauer er et nyttigt redskab til at bestemme, hvordan den transkriptionelle maskineri af cellen påvirkes af eksterne signaler (f.eks narkotikabehandling), eller hvordan celler variere mellem en sund tilstand og en syg tilstand. Med fremkomsten og kontinuerlig finjustering af næste generation af DNA-sekventering teknologi, har RNA-sekventering (RNA-seq) blevet en stadig mere populær metode til transkriptomet analyse katalogisere alle arter af transkripter, til bestemmelse af transkriptionel struktur af alle udtrykte gener og kvantificere de ændrede ekspressionsniveauer af det samlede sæt af transkripter i en given celle, væv eller organisme 1,2. RNA-seq erstatter gradvist DNA microarrays som en foretrukken fremgangsmåde til transkriptomet analyse, fordi det har fordelene ved profilering af en komplet transkriptom, tilvejebringelse af en digital type datum (kopiantallet af et transkript) og ikke afhængig af nogen kendt genomisk fortløbendece 3. Her præsenterer vi en komplet og detaljeret protokol til at anvende RNA-seq til profil transcriptomes i humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller med eller uden thrombin behandling. Denne protokol er baseret på vores seneste offentliggjorte undersøgelse med titlen &quot;RNA-seq afslører Novel transkriptom af gener og deres isoformer i Human Pulmonal mikrovaskulære endotelceller behandlet med thrombin,&quot; 4, hvor vi med succes gennemført første komplette transkriptomet analyse af humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller behandlet med thrombin ved hjælp af RNA-seq. Det gav hidtil usete ressourcer til yderligere eksperimenter at få indblik i molekylære mekanismer bag trombinmedieret endotel dysfunktion i patogenesen af ​​inflammatoriske tilstande, kræft, diabetes og hjerte-kar-sygdom, og giver potentielle nye leads til terapeutiske mål til disse sygdomme. Den beskrivende tekst til denne protokoler opdelt i fire dele. Den første del beskriver behandlingen af ​​humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller med thrombin og RNA isolation, kvalitet analyse og kvantificering. Den anden del beskriver bibliotek konstruktion og sekventering. Den tredje del beskriver dataanalyse. Den fjerde del beskriver en RT-PCR-validering assay. Repræsentative resultater af flere vigtige skridt vises. Nyttige tips eller forholdsregler for at øge succes i de vigtigste trin er tilvejebragt i Diskussion sektion. Skønt denne protokol anvender humane pulmonære mikrovaskulære endotelceller behandlet med thrombin, kan det være generaliseres til profil transcriptomes i både pattedyr-og ikke-pattedyr-celler og i væv, der er behandlet med forskellige stimuli eller inhibitorer eller til sammenligningen transcriptomes i celler eller væv mellem en sund tilstand og en sygdomstilstand.

For Trin 1: The 28s: 18s forholdet er traditionelt brugt som en indikator for RNA-nedbrydning. Ideelt set bør 28s top er omtrent dobbelt det område, som 18s båndet (et forhold på 2), men denne ideelle forhold ofte ikke ses i praksis. Endvidere 28S: kan 18s forhold opnået ved spektrofotometriske metoder undervurderer mængden af ​​nedbrydning af RNA&#39;et. For mere nøjagtigt at kvantificere den nedbrydning, og derfor kvaliteten af ​​RNA-prøve, at Experion systemet beregner en RNA kvalitet...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Denne protokol udgør en komplet og detaljeret procedure at anvende RNA-seq, en kraftfuld næste generations DNA-sekventering teknologi, til at profilere transcriptomes i humane pulmonale mikrovaskulære endotelceller med eller uden thrombin behandling. Denne protokol er generalisere til forskellige celler eller væv ramt af forskellige reagenser eller sygdomstilstande.

RNA-seq Analyse af Transcriptomes i behandlet Thrombin-og humant kontrol Pulmonal mikrovaskulære endotelceller

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrkning af human Nasal epithelialceller på Air Liquid grænseflade

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolering af microvaskulæreendothelial Tubes fra Mouse modstandskar

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse af oxidativt stress i zebrafisk embryoner

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering af murint Ventil endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection af nitrogenoxid og Superoxide i Endotel Layer af intakte arterier

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...