Name: rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Stephen Kingsmore et le Centre du génome pédiatrique Médecine des Hôpitaux de Mercy enfants et cliniques pour l&#39;utilisation de leurs grappes de calcul pour l&#39;analyse des données, Illumina équipe sur le terrain des services (Elizabeth Boyer, Scott Cook et Mark Cook) et technique équipe de consultants pour leurs réponses rapides et des suggestions utiles sur le fonctionnement de l&#39;instrument ADN séquençage de prochaine génération, HiScanSQ et analyse de la qualité des données. Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de la santé Grant HL080042 (à SQY) et le démarrage du fonds de dotation et des hôpitaux pour enfants Mercy et Cliniques, Université du Missouri à Kansas City (à SQY).

<html> Un organigramme décrivant ce protocole est affiché à la figure 1. 1. Le traitement des cellules avec de la thrombine, RNA, évaluation de la qualité et la quantification de l&#39;ARN <ol><li> Culture cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires (HMVEC-LBL) à 90-100% de confluence dans des plaques 6 puits en milieu EGM-2 avec 5% de FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques (Lonza, chat # CC-3202). </li><li> Changer médias pour les média...

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	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data.">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li><li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

Les étapes clés Manipulation d&#39;ARN: RNases se dégrade, même les plus de haute qualité d&#39;ARN, donc il faut faire attention lors de l&#39;isolement, le stockage et l&#39;utilisation de l&#39;ARN 10. Les gants sont toujours portés afin de prévenir la contamination par des RNases trouvés sur les mains de l&#39;homme. Les gants doivent être changés souvent, surtout après la peau toucher, les poignées de porte ou d&#39;autres surfaces communes. Un ensem...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Réactifs ou équipements </td><td width="85"> Entreprise </td><td width="185"> Numéro de catalogue </td><td width="359"> Commentaires </td></tr><tr><td> Cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Kit Bullet </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> Contient EGM-2, FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques </td></tr><tr><td> La thrombine </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens ARN </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> Préparation d&#39;ARN TruSeqTrousse </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Perles AMPureXP </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript II de la transcriptase inverse </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion ADN 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect Sybergreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster Génération Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Kit de contrôle </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Cycle SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> machine à qPCR - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Modèle # VIIA7 / Equipement # 10631261 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Système Experion </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer est un système alternatif </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> Bio-Tek </td><td> Spectrophotomètre pour microplaques Epoch </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Centrifugeuse - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Support magnétique </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-bien thermocycleur </td><td> Fournisseur General Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 3. Liste des réactifs et des clés E Majorquipement. * Dans la vidéo, au lieu de HiSeq1000 HiScanSQ a été démontrée. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

La caractérisation de l&#39;expression des gènes dans les cellules via la mesure des niveaux d&#39;ARNm est un outil utile pour déterminer comment la machinerie transcriptionnelle de la cellule est affectée par des signaux externes (traitement médicamenteux, par exemple), ou comment les cellules diffèrent entre un état ​​sain et un état ​​pathologique. Avec l&#39;avènement et le raffinement continu de la technologie de l&#39;ADN de la prochaine génération de séquençage, séquençage de l&#39;ARN (ARN-seq) est devenue une méthode de plus en plus populaire de l&#39;analyse du transcriptome de cataloguer toutes les espèces de transcriptions, de déterminer la structure de la transcription de tous les gènes exprimés et à quantifier les niveaux d&#39;expression de l&#39;évolution de l&#39;ensemble total de transcrits dans une cellule donnée 1,2, tissu ou organisme. ARN-seq remplace progressivement les puces à ADN comme une méthode pratique pour l&#39;analyse du transcriptome, car il a les avantages de profilage d&#39;un transcriptome complet, offrant une donnée de type numérique (nombre de copies de la transcription) et ne comptez sur aucune séquentielle génomique connueCe 3. Ici, nous présentons un protocole complète et détaillée à appliquer ARN-seq pour transcriptomes profil de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est basé sur notre étude publiée récemment intitulé «RNA-seq révèle transcriptome Novel des gènes et de leurs isoformes de l&#39;homme dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traités par la thrombine,&quot; 4, dans lequel nous avons réussi a effectué la première analyse complète du transcriptome de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traité avec de la thrombine en utilisant l&#39;ARN-seq. Elle a abouti à des ressources sans précédent pour de nouvelles expérimentations afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la thrombine dysfonction endothéliale dans la pathogénie des maladies inflammatoires, le cancer, le diabète et les maladies coronariennes, et fournit de nouvelles pistes potentielles pour cibles thérapeutiques pour ces maladies. Le texte descriptif de ce protocoleest divisé en quatre parties. La première partie décrit le traitement de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec la thrombine et d&#39;isolement d&#39;ARN, analyse de la qualité et de quantification. La deuxième partie décrit la construction de bibliothèques et de séquençage. La troisième partie décrit l&#39;analyse des données. La quatrième partie décrit un essai de validation par RT-PCR. Les résultats représentatifs de plusieurs étapes clés sont affichés. Conseils utiles ou les précautions à stimuler le succès dans les étapes clés sont fournis dans la section Discussion. Bien que ce protocole utilise de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traitées avec de la thrombine, elle peut être généralisée à transcriptomes de profil dans les deux cellules de mammifères et non mammifères et dans les tissus traités avec différents stimuli ou des inhibiteurs, ou pour comparer les transcriptomes dans des cellules ou des tissus entre un état de santé et un état de maladie.

Pour l&#39;étape 1: L&#39;28s: 18s rapport est traditionnellement utilisé comme un indicateur de la dégradation de l&#39;ARN. Idéalement, le pic 28s devrait avoir environ deux fois la surface de la bande 18 (un ratio de 2), mais cette proportion idéale n&#39;est pas souvent vu dans la pratique. En outre, 28s: 18s ratios obtenus à partir de méthodes spectrophotométriques peut sous-estimer l&#39;importance de la dégradation de l&#39;ARN. Pour plus de précision quantifier la dégradation, et donc...

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RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Ce protocole présente une procédure complète et détaillée à appliquer ARN-seq, une puissante technologie de l&#39;ADN de la prochaine génération de séquençage, de transcriptomes profil de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est généralisable à différentes cellules ou des tissus affectés par différents réactifs ou états pathologiques.

ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

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