Name: rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00
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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Stephen Kingsmore und die Kinderradiologie Genome Medicine Center im Kinderkrankenhaus Mercy Krankenhäuser und Kliniken danken für die Nutzung ihrer Computing-Cluster für unsere Datenanalyse, Illumina Außendienst (Elizabeth Boyer, Scott Cook und Mark Cook) und technische Berater-Team für die schnellen Antworten und Anregungen auf dem Lauf der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Instrument, HiScanSQ und Datenqualität Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health Grants HL080042 (um SQY) unterstützt und Start-up-Fonds und Ausstattung der Kinder Mercy Krankenhäuser und Kliniken, University of Missouri in Kansas City (auf SQY).

<html> Ein Flussdiagramm, dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein. Behandlung der Zellen mit Thrombin, RNA Isolation, Quality Assessment und Quantifizierung von RNA <ol><li> Kultur Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-LBL) 90-100% Konfluenz in 6-Well-Platten in EGM-2-Medium mit 5% FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Anderer Medien zu den Hungermedium (0% FBS) 30 min vor der Behandlung mit Thrombin. </li><li> Behand...

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. 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Wichtige Schritte RNA Handhabung: RNasen sogar verschlechtern die meisten hochwertigen RNA, daher muss darauf bei der Isolierung, Lagerung und Verwendung von RNA 10 entnommen werden. Handschuhe sind immer getragen werden, um Verschmutzungen durch RNasen auf die menschliche Hände fanden verhindern. Handschuhe sollten häufig gewechselt werden, insbesondere nach dem Berühren der Haut, Türklinken oder anderen gängigen Oberflächen. Eine Reihe von Pipetten sollten au...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Reagenzien oder Ausrüstungen </td><td width="85"> Firma </td><td width="185"> Katalognummer </td><td width="359"> Kommentare </td></tr><tr><td> Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Bullet Kit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2 enthält, FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika </td></tr><tr><td> Thrombin </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA-PräparationSatz </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP Beads </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript Reverse Transkriptase II </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster-Generation Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Control Kit </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Zyklus SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR Maschine - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Model # VIIA7 / Equipment # 10631261 </td><td> Oder gleichwertig </td></tr><tr><td> Experion-System </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer ist ein alternatives System </td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> Bio-Tek </td><td> Epoch Mikroplatten-Spektralphotometer </td><td> Oder gleichwertig </td></tr><tr><td> Zentrifuge - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Oder gleichwertig </td></tr><tr><td> Magnetfuß </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well Thermocycler </td><td> General Lab Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 3. Liste der Key Reagenzien und Major Equipment. *, In dem Video wurde HiSeq1000 statt HiScanSQ demonstriert. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

Die Charakterisierung der Genexpression in Zellen über Messung der mRNA ist ein nützliches Werkzeug bei der Bestimmung, wie der transkriptionellen Maschinerie der Zelle von externen Signalen (zB Arzneimittelbehandlung) oder wie Zellen unterscheiden zwischen einem gesunden Zustand und einem erkrankten Zustand ist betroffen. Mit dem Aufkommen und kontinuierliche Weiterentwicklung der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Technologie hat RNA-Sequenzierung (RNA-seq) eine zunehmend beliebte Methode der Transkriptom-Analyse, um alle Arten von Transkripten zu katalogisieren, um die transkriptionelle Struktur aller exprimierten Gene zu ermitteln und zu quantifizieren die wechselnden Expressionsniveaus des gesamten Satzes von Transkripten in einer bestimmten Zelle, Gewebe oder Organismus 1,2. RNA-seq ersetzt nach DNA-Mikroarrays als bevorzugte Methode für die Transkriptom-Analyse, da sie die Vorteile der Profilierung eine komplette Transkriptom hat, ein digitales Typ Datum (Kopienzahl jeder transcript) und sich auf keine bekannten genomischen sequence 3. Hier stellen wir eine vollständige und detaillierte Protokoll RNA-seq zum Profil Transkriptomen gelten in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung. Dieses Protokoll basiert auf unseren kürzlich veröffentlichten Studie mit dem Titel basiert &quot;RNA-seq enthüllt Novel Transkriptom von Genen und deren Isoformen in Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin behandelt,&quot; 4, in denen wir erfolgreich durchgeführt die erste komplette Transkriptom-Analyse der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen behandelt mit Thrombin mittels RNA-seq. Es ergab beispiellose Ressourcen für weitere Experimente, um Einblicke in die molekularen Mechanismen, die Thrombin-vermittelte endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen, Krebs, Diabetes und koronare Herzkrankheit zu gewinnen, und bietet potenziellen neuen Leads für therapeutische Targets zu diesen Krankheiten. Der beschreibende Text des Protokollsist in vier Teile gegliedert. Der erste Teil beschreibt die Behandlung von pulmonaler menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin und RNA-Isolation, Qualität Analyse und Quantifizierung. Der zweite Teil beschreibt Aufbau der Bibliothek und Sequenzierung. Der dritte Teil beschreibt die Analyse der Daten. Der vierte Teil beschreibt einen RT-PCR Validierung Assay. Repräsentative Ergebnisse von mehreren wichtigen Schritten angezeigt. Nützliche Tipps oder Hinweise auf zu Erfolg in wichtigen Schritten zu steigern sind in der Diskussion Abschnitt. Obwohl dieses Protokoll verwendet menschlichen pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen mit Thrombin behandelt wird, kann es sein, generalisierte zum Profil Transkriptomen in beiden Säuger und Nicht-Säuger-Zellen und in Geweben mit unterschiedlichen Stimuli oder Inhibitoren oder Transkriptomen in Zellen oder Geweben zwischen einem gesunden Zustand vergleichen behandelten und einen Krankheitszustand.

Für Schritt 1: Die 28s: 18s-Verhältnis wird traditionell als Indikator für die RNA-Abbau verwendet. Idealerweise sollte die 28s Peak etwa doppelt der Fläche der 18s Band (ein Verhältnis von 2) aufweisen, wird dies jedoch oft nicht ideale Verhältnis in der Praxis angesehen. Weiterhin 28s: 18s können Verhältnisse von spektrophotometrischen Methoden erhalten unterschätzen die Menge des Abbaus der RNA. Um genauer zu quantifizieren den Abbau und somit die Qualität der RNA-Probe, berechnet das Syste...

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RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Dieses Protokoll stellt eine vollständige und detaillierte Verfahren zur RNA-seq, eine leistungsstarke Next-Generation-DNA-Sequenzierung Technologie zum Profil Transkriptomen in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung anzuwenden. Dieses Protokoll ist generalisierbar verschiedenen Zellen oder Geweben von verschiedenen Reagenzien oder Krankheitszuständen befallen.

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...