Name: rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00
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저자는 우리의 데이터 분석을 위해 자신의 컴퓨팅 클러스터의 사용에 대한 어린이의 자비 병원 및 클리닉에서 박사 스티븐 Kingsmore 및 소아 게놈 의학 센터에 진심으로 감사드립니다, Illumina의 현장 서비스 팀 (엘리자베스 Boyer, 스콧 쿡과 마크 쿡) 및 기술 자신의 빠른 응답 및 차세대 DNA 시퀀싱 장비, HiScanSQ, 데이터 품질 분석의 실행에 대한 유용한 제안에 대한 컨설턴트 팀. 이 작품은 건강 기금 HL080042 (SQY까지) 국립 연구소에 의해 일부 지원과 어린이의 자비 병원과 클리닉의 시동 기금과 기금, 캔사스 시티의 미주리 대학 (SQY까지).되었습니다

<html> 이 프로토콜을 요약 순서도는 그림 1에 표시됩니다. 1. 트롬빈, RNA 분리, RNA의 품질 평가 및 정량화와 세포의 치료 <ol><li> 5% FBS, 성장 요인 및 항생제와 EGM-2 중간에 6 잘 접시에 90~100%의 합류로 문화 인간 폐 Microvascular 내피 세포 (HMVEC-LBl) (Lonza, 고양이 # CC-3202). </li><li> 기아 미디어 (0 % FBS) 이전 트롬빈 치료를 30 분에 미디어를 변경합니다. </li><li> 0.05 U / ML 트롬빈...

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. 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주요 단계 RNA 처리 : RNases는, 가장 높은 품질의 RNA를 저하됩니다 따라서 치료는 RNA (10)의 분리, 저장, 사용하는 동안주의해야합니다. 장갑은 항상 인간의 손에있는 RNases하여 오염을 방지하기 위해 착용하고 있습니다. 장갑은 특히 터치 피부, 문 손잡이 또는 기타 일반적인 표면 후, 자주 변경해야합니다. 피펫의 세트 작업을 RNA에 전적으로 헌신해야하고 모?...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> 시약 및 장비 </td><td width="85"> 회사 </td><td width="185"> 카탈로그 번호 </td><td width="359"> 코멘트 </td></tr><tr><td> 인간 폐 Microvascular 내피 세포 </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, 글 머리 기호 키트 </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2, FBS, 성장 요인 및 항생제를 포함 </td></tr><tr><td> 트롬빈 </td><td> 시그마 </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion 미르 Vana 키트 </td><td> 생명 기술 </td><td> 오전 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-해치 </td><td> 생명 기술 </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> 바이오 RAD </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA 준비키트 </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP 비즈 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> 어깨 역 Transcriptase II </td><td> 생명 기술 </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA의 1K </td><td> 바이오 RAD </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE 클러스터 생성 키트 </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX 제어 키트 </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 사이클 SBS 키트 </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> cBot </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR 기계 - Viia7 </td><td> 생명 기술 </td><td> 모델 # VIIA7 / 장비 # 10631261 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> Experion 시스템 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer는 다른 시스템입니다 </td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> 바이오 테크 </td><td> 시대 Microplate 분광 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 - Sorvall 전설 XTR </td><td> 열 과학 </td><td> 75004521 </td><td> 또는 동급 </td></tr><tr><td> 자기 스탠드 </td><td> 생명 기술 </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> thermocycler 96 - 웰 </td><td> 일반 실험실 공급 업체 </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 주요 시약 및 주요 E 표 3. 목록quipment. * 동영상에서는 대신 HiScanSQ의 HiSeq1000이 입증되었습니다. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

mRNA 수준의 측정을 통해 세포의 유전자 발현의 특성은 세포의 전사 기계가 외부 신호 (예 : 약물 치료), 또는 어떻게 세포가 건강한 상태와 병에 걸린 상태 사이의 차이에 의해 영향을하는 방법을 결정하는 유용한 도구입니다. 차세대 DNA 시퀀싱 기술의 출현과 지속적인 개량을 통해 RNA-시퀀싱 (RNA-seq)는 성적 증명서의 모든 종류를 분류하기위한 모든 표현 유전자의 전사 구조를 파악하고 계량화 할 수 transcriptome 분석의 점점 인기있는 방법이되었다 주어진 셀, 조직 또는 유기체 1,2의 성적 증명서의 총 집합의 변화 표현 수준. RNA-seq은 점차 그 완전한 transcriptome를 프로파일의 장점을 가지고 있기 때문에, transcriptome 분석을위한 선호하는 방법으로 DNA의 microarrays를 대체하는 디지털 형 자료 (모든 증명서의 사본 번호)를 제공하고 알려진 게놈의 sequen에 의존하지 않습니다CE 3. 여기, 우리는 함께 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포에 프로필 transcriptomes에 RNA-seq를 적용 할 수있는 완전하고 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 자격이 최근 출판 연구에 기초가 성공적으로 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 첫 번째 전체 transcriptome 분석을 수행하는 4 &quot;RNA-seq은 트롬빈으로 치료 인간의 폐 Microvascular 내피 세포의 유전자와 Isoforms의 소설 Transcriptome를 보여&quot; 트롬빈은 RNA-seq을 사용하여 치료. 그것은 염증 조건, 암, 당뇨병, 관상 동맥 심장 질환의 pathogenesis에 트롬빈로 인한 내피 기능 장애의 근간이 분자 메커니즘에 통찰력을 얻기 위해 추가 실험을위한 전례없는 자원을 굴복, 이러한 질병에 대한 치료 타겟에 대한 잠재적 인 새 리드를 제공합니다. 이 프로토콜의 설명 텍스트네 부분으로 나누어 져 있습니다. 첫 번째 부분은 트롬빈과 RNA 분리, 품질 분석 및 정량화와 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 치료에 대해 설명합니다. 두 번째 부분은 도서관 건설 및 시퀀싱에 대해 설명합니다. 세 번째 부분은 데이터 분석에 대해 설명합니다. 네 번째 부분은 RT-PCR 검증 분석을 설명합니다. 몇 가지 주요 단계를 대표 결과가 표시됩니다. 주요 단계에서의 성공을 높일 수 유용한 팁이나주의 사항은 토론 섹션에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 트롬빈로 치료 인간의 폐 microvascular 내피 세포를 사용하지만, 그것은 포유류와 비 포유류의 세포 모두에서 서로 다른 자극이나 억제제, 또는 건강 상태 사이의 셀이나 조직에 transcriptomes를 비교로 치료 조직의 프로필 transcriptomes에 일반화 할 수 및 질병 상태.

1 단계의 경우 : 28s : 18의 비율은 전통적으로 RNA 저하의 지표로 사용됩니다. 이상적으로, 28s 피크는 18 밴드 (2의 비율)의 약 두 배 공간을 갖추고해야하지만이 이상적인 비율은 자주 연습에서 볼 수 없습니다. 또한, 28s : 분광 방법에서 얻은 18 비율은 RNA의 저하의 양을 과소 평가 할 수 있습니다. 보다 정확하게 저하, 따라서 RNA 샘플의 품질을 수량화하기 위해 Experion 시스템은 RNA 품질 표...

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RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

이 프로토콜은 다음과 같은 또는 트롬빈 치료없이 인간의 폐 microvascular 내피 세포의 프로필 transcriptomes에 RNA-seq, 강력한 차세대 DNA 시퀀싱 기술을 적용 할 완전하고 자세한 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 시약 또는 질병 상태에 의해 영향을 다양한 세포 나 조직에 generalizable 수 있습니다.

RNA-seq의 트롬빈 - 처리의 Transcriptomes 분석 및 제어 인간 폐 Microvascular 내피 세포

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

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