Name: rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Stephen Kingsmore e do Centro de Medicina Pediátrica Genoma em hospitais pediátricos Mercy e clínicas para o uso de clusters de computação para a nossa análise de dados, a equipe de Illumina serviço de campo (Elizabeth Boyer, Scott Cook e Mark Cook) e técnico equipa de consultores para as suas respostas rápidas e sugestões úteis sobre o funcionamento do instrumento de próxima geração de sequenciamento de DNA, HiScanSQ e análise de dados de qualidade. Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health Grant HL080042 (para SQY) e start-up fundo e dotação de hospitais infantis de Misericórdia e Clínicas, da Universidade de Missouri, em Kansas City (para SQY).

<html> Um fluxograma descrevendo este protocolo é mostrado na Figura 1. 1. O tratamento de células com trombina, RNA Isolation, Quality Assessment e Quantificação de RNA <ol><li> Cultura As células endoteliais microvasculares de pulmão humano (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluência em placas de 6 poços em meio EGM-2 com 5% de FBS, factores de crescimento e antibióticos (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Alterar media para os meios de comunicação de fome (0% de FBS) 30 m...

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data.">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li><li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

As principais etapas Manipulação de RNA: RNases irá degradar ainda os mais elevada qualidade de ARN, por isso deve ser tomado cuidado durante o isolamento, o armazenamento e utilização de RNA 10. Luvas são sempre usadas para evitar a contaminação por RNases encontrados em mãos humanas. As luvas devem ser mudados frequentemente, especialmente depois de tocar a pele, maçanetas ou outras superfícies comuns. Um conjunto de pipetas deve ser dedicado exclusivame...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Reagentes ou Equipamentos </td><td width="85"> Companhia </td><td width="185"> Número de catálogo </td><td width="359"> Comentários </td></tr><tr><td> As células endoteliais microvasculares de pulmão humano </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Kit Bala </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> Contém EGM-2, FBS, factores de crescimento e antibióticos </td></tr><tr><td> Trombina </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA PreparaçãoConjunto </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Contas AMPureXP </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Sobrescrito transcriptase reversa II </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion 1K DNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster Geração Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Controle Kit </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Ciclo SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR máquina - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Equipamento Model # VIIA7 / # 10631261 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> Experion Sistema </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer é um sistema alternativo </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro </td><td> Bio-Tek </td><td> Epoch Microplaca Espectrofotômetro </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> Centrífuga - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> Suporte magnético </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96 poços termociclador </td><td> Geral Fornecedor Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lista Tabela 3. Dos Reagentes chave e Mi Maiorquipment. *, No vídeo, em vez de HiSeq1000 HiScanSQ foi demonstrada. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

A caracterização da expressão do gene em células por meio de medição de níveis de mRNA é uma ferramenta útil na determinação de como a maquinaria transcricional da célula é afectada por sinais externos (por exemplo, tratamento com drogas), ou como células diferem entre um estado saudável e de um estado de doença. Com o advento e aperfeiçoamento contínuo da próxima geração de tecnologias de sequenciação de DNA, RNA-sequenciação (RNA-seq) tornou-se um método cada vez mais popular de análise do transcriptoma para catalogar todas as espécies de transcritos, para determinar a estrutura da transcrição de todos os genes expressos e quantificar os níveis de expressão de mudar o conjunto total de transcritos de 1,2 um tecido, célula ou organismo determinado. RNA-seq está a substituir gradualmente microarranjos de DNA como um método preferido para a análise do transcriptoma porque tem as vantagens de um perfil transcriptoma completa, proporcionando um dado tipo digital (número de cópias de qualquer transcrição) e não se basear em qualquer sequen genómico conhecidoce 3. Aqui, apresentamos um protocolo completo e detalhado para aplicar RNA-seq para transcriptomas perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com ou sem tratamento de trombina. Este protocolo é baseado em nosso estudo recente publicado intitulado &quot;RNA-seq revela Transcriptoma Novel de genes e suas isoformas em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares Tratados com trombina,&quot; 4 em que realizaram com sucesso a primeira análise completa do transcriptoma humano pulmonares células endoteliais microvasculares tratado com trombina usando RNA-seq. Ele rendeu recursos sem precedentes para a experimentação ainda mais para obter insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes trombina mediada disfunção endotelial na patogênese de doenças inflamatórias, câncer, diabetes e doença cardíaca coronária, e fornece novas pistas para potenciais alvos terapêuticos para essas doenças. O texto descritivo deste protocoloé dividido em quatro partes. A primeira parte descreve o tratamento de humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com trombina e isolamento de ARN, análise de qualidade e de quantificação. A segunda parte descreve a construção da biblioteca e seqüenciamento. A terceira parte descreve a análise de dados. A quarta parte descreve um ensaio de RT-PCR de validação. Os resultados representativos de vários passos-chave são exibidos. Dicas úteis ou precauções para impulsionar o sucesso em passos-chave são fornecidos na seção de Discussão. Embora este protocolo utiliza humanas pulmonares células endoteliais microvasculares tratados com trombina, pode ser generalizado para transcriptomas perfil em ambas as células de mamíferos e não mamíferos e dos tecidos tratados com diferentes estímulos ou inibidores, ou para comparar transcriptomas em células ou tecidos entre um estado saudável e um estado de doença.

Para o Passo 1: O 28s: 18s razão é tradicionalmente utilizada como um indicador da degradação de ARN. Idealmente, o pico 28s deverá ter aproximadamente duas vezes a área da banda de 18s (uma proporção de 2), no entanto este rácio ideal não é muitas vezes visto na prática. Além disso, 28s: 18s rácios obtidos a partir de métodos espectrofotométricos pode subestimar a quantidade de degradação do RNA. Para quantificar mais precisamente a degradação, e, por conseguinte, a qualidade da amo...

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RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Este protocolo apresenta um procedimento completa e detalhada para aplicar RNA-seq, uma tecnologia de DNA poderoso próxima geração de sequenciação, de transcriptomas de perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares, com ou sem tratamento com trombina. Este protocolo é generalizável a várias células ou tecidos afetados por reagentes ou estados diferentes doenças.

RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Research

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