Name: rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00
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Los autores desean agradecer al Dr. Stephen Kingsmore y el Centro de Medicina del Genoma pediátrica en hospitales Mercy infantiles y clínicas para el uso de clusters sus computacionales para el análisis de datos, el equipo de iluminación de campo de servicio (Elizabeth Boyer, Cook Scott y Cook, Mark) y técnicos consultor equipo por sus respuestas rápidas y sugerencias útiles sobre el funcionamiento del instrumento generación siguiente secuenciación de ADN, HiScanSQ y análisis de datos de calidad. Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud Grant HL080042 (a SQY) y la puesta en marcha del fondo y la dotación de los hospitales Mercy niños y las Clínicas de la Universidad de Missouri en Kansas City (a SQY).

<html> Un diagrama de flujo delinear este protocolo se muestra en la figura 1. 1. El tratamiento de células con trombina, Aislamiento de ARN, Evaluación de la Calidad y cuantificación de ARN <ol><li> Cultivar células endoteliales microvasculares de pulmón (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluencia en placas de 6 pocillos en medio EGM-2 con 5% de SFB, factores de crecimiento y antibióticos (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Cambiar el medio a los medios de inanición (0% FBS) 30...

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	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. 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G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

Los pasos clave Manejo de ARN: RNasas se degradará hasta la más alta calidad del ARN, por lo tanto se debe tener cuidado durante el aislamiento, el almacenamiento y el uso de RNA 10. Los guantes se usan siempre para prevenir la contaminación por RNasas se encuentran en manos humanas. Los guantes deben ser cambiados con frecuencia, especialmente después de tocar la piel, pomos de las puertas u otras superficies comunes. Un conjunto de las pipetas deben estar dedic...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Los reactivos o equipos </td><td width="85"> Empresa </td><td width="185"> El número de catálogo </td><td width="359"> Comentarios </td></tr><tr><td> Las células pulmonares humanas endoteliales microvasculares </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Kit de bala </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> Contiene EGM-2, FBS, factores de crecimiento y antibióticos </td></tr><tr><td> La trombina </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens ARN </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq ARN PreparaciónEquipo </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP Beads </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Superíndice II Reverse Transcriptase </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion ADN 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Generación Cluster Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Kit de control </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Ciclo SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> máquina qPCR - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Modelo # VIIA7 / Equipo # 10631261 </td><td> O el equivalente </td></tr><tr><td> Experion Sistema </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer es un sistema alternativo </td></tr><tr><td> Espectrofotómetro </td><td> Bio-Tek </td><td> Espectrofotómetro para Microplacas Epoch </td><td> O el equivalente </td></tr><tr><td> Centrífuga - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> O el equivalente </td></tr><tr><td> Soporte magnético </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 pocillos del termociclador </td><td> Laboratorio General de Proveedor </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabla 3. Lista de los reactivos clave y E Majorquipment. * En el video, en lugar de HiSeq1000 HiScanSQ se demostró. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

La caracterización de la expresión génica en las células a través de la medición de los niveles de mRNA es una herramienta útil en la determinación de cómo la maquinaria transcripcional de la célula se ve afectado por señales externas (por ejemplo, tratamiento de drogas), o cómo difieren entre las células un estado saludable y un estado de enfermedad. Con el advenimiento y refinamiento continuo de la tecnología de ADN secuenciación de próxima generación, ARN-secuenciación (RNA-seq) se ha convertido en un método cada vez más popular de análisis del transcriptoma para catalogar todas las especies de transcripciones, para determinar la estructura de la transcripción de todos los genes expresados ​​y cuantificar los cambios en los niveles de expresión de la serie total de transcripciones en un 1,2 dado célula, tejido u organismo. RNA-seq está reemplazando gradualmente microarrays de ADN como un método preferido para el análisis de transcriptoma porque tiene las ventajas de un perfil de un transcriptoma completa, proporcionando un dato de tipo digital (número de copias de cualquier transcripción) y no depender de cualquier secuencial genómico conocidoce 3. A continuación, presentamos un protocolo completo y detallado para aplicar RNA-seq para transcriptomes perfil pulmonares humanas en células endoteliales microvasculares con o sin tratamiento con trombina. Este protocolo se basa en el estudio recientemente publicado titulado &quot;RNA-seq revela Transcriptome novela de genes y sus isoformas en humanos células endoteliales microvasculares pulmonares tratadas con trombina,&quot; 4 en el que realizó con éxito el primer análisis completo de transcriptoma humano pulmonar de células endoteliales microvasculares tratados con trombina utilizando ARN-seq. Cedió recursos sin precedentes para nuevos experimentos para comprender mejor los mecanismos moleculares que subyacen a la trombina mediada por disfunción endotelial en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias, cáncer, diabetes y enfermedad cardiaca coronaria, y proporciona nuevas pistas para posibles dianas terapéuticas para estas enfermedades. El texto descriptivo de este protocolose divide en cuatro partes. La primera parte se describe el tratamiento de humanos pulmonar de células endoteliales microvasculares con trombina y el aislamiento de ARN, análisis de la calidad y la cuantificación. La segunda parte describe la construcción de bibliotecas y la secuenciación. La tercera parte se describe el análisis de datos. La cuarta describe un ensayo de validación de RT-PCR. Los resultados representativos de varios pasos claves se muestran. Consejos útiles y precauciones para impulsar el éxito en los pasos claves se proporcionan en la sección de debate. Aunque este protocolo utiliza humanos pulmonar de células endoteliales microvasculares tratados con trombina, que se pueden generalizar a transcriptomes perfil tanto en células de mamíferos y no mamíferos y en los tejidos tratados con diferentes estímulos o inhibidores, o para comparar transcriptomes en células o tejidos entre un estado saludable y un estado de enfermedad.

Para el Paso 1: El 28s: relación de 18 años se utiliza tradicionalmente como un indicador de la degradación del ARN. Idealmente, el pico 28s debería tener aproximadamente dos veces el área de la banda de 18 años (una proporción de 2), sin embargo esta relación ideal no se ve a menudo en la práctica. Además, 28s: 18s coeficientes obtenidos a partir de métodos espectrofotométricos se puede subestimar la cantidad de degradación del ARN. Para cuantificar con mayor precisión la degradación, y ...

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RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Este protocolo presenta un procedimiento completo y detallado de aplicar RNA-seq, una potente tecnología de próxima generación de secuenciación de ADN, a transcriptomes perfil en humanos células endoteliales microvasculares pulmonares con o sin tratamiento con trombina. Este protocolo es generalizable a diversas células o tejidos afectados por diferentes reactivos o estados de enfermedad.

RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

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El aislamiento de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Investigación

Biología

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

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Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

El cultivo de células humanas epiteliales nasales en la interfase aire líquido

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

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Análisis de estrés oxidativo en embriones de pez cebra

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En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas

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-Alta resolución de imagen de lapso de tiempo y análisis automatizado de los microtúbulos en la dinámica de estar umbilical humana Las células endoteliales de vena

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In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

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Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

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