Name: f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00
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1. Mitochondrien-Isolation (Angepasst von Braun MR et al. 9) <ol><li> Sacrifice die Ratte unter Verwendung von Methoden der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. </li><li> Schneiden Sie den Kopf des Tieres durch Enthauptung, schneiden Sie die Haut und setzen den Schädel. </li><li> Öffnen Sie den Schädel sanft durch Schneiden mit einer Schere oder Zange. Entfernen Sie das Gehirn. </li><li> Mince fein das Gehirn ohne Kleinhirn in Isolation Buffer (siehe Tabelle 1)...

<ol>
	<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease.">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li><li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis,+autophagy+and+control+of+metabolism.">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).</li><li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit.">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li><li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+ATP+synthase:+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits.">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li><li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bcl-2+family:+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis.">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li><li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+proteins:+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis.">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li><li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li><li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities.">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li><li>Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+Synthasomes.">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li></ol>

Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen die Gewinnung von reinem Mitochondrien am Ende von Schritt 1 und submitochondrialen Vesikel (SMVS) nach Schritt 2 aus ganzen Gehirn ohne Unterschied der Zelle durch dieses Verfahren phenotypes.SMVspurified im wesentlichen frei von Verunreinigung durch andere subzelluläre Organellen, wie in Abbildung 1 und unserer bisherigen Arbeit (Alavian KN et al. 8) und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität vor dem Einfrieren. Nach...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle</td>
 <td>Krackeler Scientific, Inc.</td>
 <td>1-7725T-5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5424 000.410</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4639 Cell Disruption Vessel</td>
 <td>Parr Instrument Company</td>
 <td>4639</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F5415</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>P20314</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SW-50.1 rotor </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L8-70M Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5628 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lubrol PX (C12E9) </td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>205534</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axopatch 200B </td>
 <td>Axon Instruments </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1440A </td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp10.0</td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulator</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capillary</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1308325</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes

Mitochondrien sind in vielen wichtigen zellulären Funktionen wie Stoffwechsel, Überleben 1, Entwicklung und Calcium-Signalgebung 2 beteiligt. Zwei der wichtigsten mitochondrialen Funktionen sind auf die effiziente Produktion von ATP, die Energie Währung der Zelle, die durch oxidative Phosphorylierung und die Vermittlung von Signalen für den programmierten Zelltod 3 bezogen. Das Enzym in erster Linie verantwortlich für die Produktion von ATP ist die F1FO-ATP-Synthase, auch als ATP-Synthase 4-5. In den letzten Jahren hat sich die Rolle der Mitochondrien in apoptotischen und nekrotischen Zelltod erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. In apoptotischen Zelltod, geben Bcl-2-Proteine ​​wie Bax äußeren Mitochondrienmembran, Oligomerisierung und Permeabilisierung der äußeren Membran, die Freigabe pro-apoptotische Faktoren in das Cytosol 6. In der klassischen nekrotischen Zelltod, wie die durch Ischämie oder Exzitotoxizität in Neuronen eine größ produzierte, schlecht reguliert Erhöhung Matrix Calcium trägt zur Öffnung der inneren Membran Poren, die mitochondriale Permeabilität Übergang Pore oder mPTP. Diese depolarisiert die innere Membran und verursacht osmotischen Verschiebungen, einen Beitrag zur äußeren Membran Ruptur, die Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren und Stoffwechselstörungen. Viele Proteine ​​einschließlich Bcl-xL 7 interagieren F1FO ATP-Synthase, stetig seine Funktion. Bcl-xL interagiert direkt mit der beta-Untereinheit der ATP-Synthase F1FO, und diese Interaktion vermindert ein Leck Leitwert innerhalb der F1FOATPasecomplex, die Erhöhung der Netto-Transport von H + durch F1FO während F1FO ATPase Aktivität 8 und wodurch mitochondrialen Effizienz. Um die Aktivität und Modulation der ATP-Synthase studieren isolierten wir aus Nagergehirn submitochondrialen Vesikel (SMVS) enthält F1FO ATPase. Die SMVS behalten die strukturelle und funktionelle Integrität des F1FO ATPase nach Alavian et al. Hier beschreiben wir eine Methodedass wir erfolgreich für die Isolierung von SMVS aus Rattenhirn verwendet und wir Abgrenzung der Patch-Clamp-Technik, um Kanal-Aktivität zu analysieren (ion Leck Leitwert) der SMVS.

Der erste Schritt der Protokoll ermöglicht für die Isolierung von Mitochondrien gereinigt, wie durch Western-Blot in Fig. 1 gezeigt. In Abbildung 2 ist ein Beispiel für einen brain-derived submitochondrialen Vesikel Patch Aufnahme gezeigt. Mit der inside-out Patch Konfiguration zeigen wir Kanalaktivität moduliert durch ATP. Die Steuerung (CTL) die Aufnahme (links) zeigt Multi-Kanal-Aktivität Leitfähigkeit mit einem Spitzenwert Leitfähigkeit von 600 pS im Durchschnitt. das wurde u...

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F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Eine Methode, um submitochondrialen Vesikel in F1FO ATP-Synthase-Komplexe aus Rattenhirn angereichert isolieren beschrieben. Diese Vesikel erlauben das Studium der Aktivität von F1FO ATPase-Komplex und dessen Modulation unter Verwendung der Technik der Patch-Clamp-Aufnahme.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

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