Name: f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00
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1. Cervello mitocondriale Isolamento (Adattato da Brown MR et al. 9) <ol><li> Sacrifica il topo utilizzando metodi approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa (IACUC). </li><li> Tagliare la testa dell&#39;animale per decapitazione, tagliare la pelle ed esporre il cranio. </li><li> Aprire delicatamente il cranio, tagliando con una forbice o rongeur. Rimuovere il cervello. </li><li> Tritate finemente il cervello senza cervelletto in isolamento Buffer (vedi tabella 1)</...

<ol>
	<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease.">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li><li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis,+autophagy+and+control+of+metabolism.">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).</li><li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit.">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li><li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+ATP+synthase:+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits.">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li><li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bcl-2+family:+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis.">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li><li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+proteins:+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis.">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li><li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li><li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities.">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li><li>Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+Synthasomes.">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li></ol>

I metodi qui descritti permettono l&#39;isolamento di puro mitocondri alla fine del passaggio 1 e vescicole submitocondriali (SMVs) dopo il passo 2 dal cervello intero senza distinzione di cella phenotypes.SMVspurified da questo metodo sono essenzialmente esente da contaminazione da altri organelli subcellulari come mostrato nella figura 1 e nostro precedente lavoro (Alavian KN et al. 8) e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale prima del congelamento. Dopo il congelam...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle</td>
 <td>Krackeler Scientific, Inc.</td>
 <td>1-7725T-5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5424 000.410</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4639 Cell Disruption Vessel</td>
 <td>Parr Instrument Company</td>
 <td>4639</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F5415</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>P20314</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SW-50.1 rotor </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L8-70M Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5628 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lubrol PX (C12E9) </td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>205534</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axopatch 200B </td>
 <td>Axon Instruments </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1440A </td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp10.0</td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulator</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capillary</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1308325</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes

I mitocondri sono coinvolti in molte importanti funzioni cellulari tra cui il metabolismo, la sopravvivenza a 1, di sviluppo e, di segnalazione di calcio 2. Due delle più importanti funzioni mitocondriali sono legati alla produzione efficiente di ATP, la moneta energetica della cellula, dalla fosforilazione ossidativa e la mediazione di segnali per morte cellulare programmata 3. L&#39;enzima principale responsabile della produzione di ATP sintasi è il F1FO-ATP, chiamato anche ATP sintasi 4-5. Negli ultimi anni, il ruolo dei mitocondri nella morte cellulare per apoptosi e necrotiche ha ricevuto notevole attenzione. In morte cellulare per apoptosi, Bcl-2 proteine ​​della famiglia come Bax entrare la membrana mitocondriale esterna, oligomerize e permeabile la membrana esterna, rilasciando fattori pro-apoptotici nel citosol 6. In classico necrosi cellulare, come quello prodotto da ischemia o eccitotossicità nei neuroni, un large, aumento insufficiente regolazione in matrice calcio contribuisce all&#39;apertura di un poro membrana interna, la permeabilità mitocondriale poro di transizione o mPTP. Questo depolarizza la membrana interna e provoca cambiamenti osmotici, contribuendo alla rottura della membrana esterna, rilascio di fattori pro-apoptotici, e disfunzione metabolica. Molte proteine ​​tra cui Bcl-xL 7 interagiscono con F1FO ATP sintasi, modulando la sua funzione. Bcl-xL interagisce direttamente con la subunità beta della F1FO ATP sintasi, e questa interazione decresce una conduttanza di perdita entro il F1FOATPasecomplex, aumentando il trasporto netto di H + da F1FO durante F1FO ATPasi 8 e aumentando quindi l&#39;efficienza mitocondriale. Per studiare l&#39;attività e la modulazione della ATP sintasi, abbiamo isolato dal cervello di roditori submitocondriali vescicole (SMVs) contenenti F1FO ATPasi. Le SMVs mantengono l&#39;integrità strutturale e funzionale del F1FO ATPasi come mostrato in Alavian et al. Qui, descriviamo un metodoche abbiamo usato con successo per l&#39;isolamento di SMVs da cervello di ratto e noi delineare la tecnica patch clamp per analizzare l&#39;attività del canale (conduttanza perdita ion) delle SMVs.

Il primo passo del nostro protocollo consente l&#39;isolamento di mitocondri purificati come mostrato mediante Western blot in Figura 1. In figura 2 è mostrato un esempio di un derivato dal cervello submitocondriali registrazione cerotto vescicola. Utilizzando la configurazione di patch dentro-fuori dimostriamo attività del canale modulato da ATP. Il controllo (CTL) di registrazione (a sinistra) mostra l&#39;attività del canale multi-conduttanza con una conducibilità massima di 600 ...

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F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Un metodo per isolare vescicole submitocondriali arricchiti in F1FO ATP sintasi complessi da cervello di ratto è descritto. Queste vescicole permettono lo studio dell&#39;attività del complesso F1FO ATPasi e la sua modulazione utilizzando la tecnica di patch clamp di.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPasi Vesicle Preparazione e tecnica per permettere Bloccare Registrazioni patch di membrane delle vescicole submitocondriali

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

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