Name: f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00
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1。脳ミトコンドリア単離（ ブラウンMRらから適応。9） <ol><li>インスティテューショナルアニマルケアと使用委員会（IACUC）によって承認された方法を用いてラットを生け贄に捧げる。 </li><li>断頭により、動物の頭をカットし、皮膚をカットし、頭蓋骨を公開します。 </li><li>はさみや骨鉗子で切断してそっと頭蓋骨を開きます。脳を取り外します。 </li><li>分離バッファにお?...

<ol>
	<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease.">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li><li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis,+autophagy+and+control+of+metabolism.">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).</li><li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit.">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li><li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+ATP+synthase:+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits.">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li><li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bcl-2+family:+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis.">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li><li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+proteins:+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis.">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li><li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li><li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities.">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li><li>Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+Synthasomes.">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li></ol>

この方法によってphenotypes.SMVspurified細胞の区別なく全脳から、手順2の後にここに、ステップ1の終了時に純粋なミトコンドリアの分離を可能にし、亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）に記載された方法は、に示されているように他の細胞内小器官による汚染の本質的に自由である図1に、私たちの前の仕事（Alavian KN ら 8）、凍結前にその構造と機能の整合性を保持しま?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle</td>
 <td>Krackeler Scientific, Inc.</td>
 <td>1-7725T-5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5424 000.410</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4639 Cell Disruption Vessel</td>
 <td>Parr Instrument Company</td>
 <td>4639</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F5415</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>P20314</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SW-50.1 rotor </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L8-70M Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5628 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lubrol PX (C12E9) </td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>205534</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axopatch 200B </td>
 <td>Axon Instruments </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1440A </td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp10.0</td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulator</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capillary</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1308325</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes

ミトコンドリア代謝、生存1、開発および、カルシウムシグナリング2を含む多くの重要な細胞機能に関与している。最も重要なミトコンドリア機能の二つはATP、酸化的リン酸化による細胞のエネルギー通貨、およびプログラムされた細胞死3つの信号の調停を効率よく製造に関連している。 ATPの生産を主に担当する酵素はまた、ATP合成酵素と呼ばれる4-5 F1FO-ATP合成酵素である。近年では、アポトーシスおよび壊死細胞死におけるミトコンドリアの役割は、かなりの注目を集めている。アポトーシス細胞死では、このようなBaxのようなBCL-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリア外膜を入力してオリゴマー化し、サイトゾル6にプロアポトーシス因子を放出し、外膜を透過性。古典的な壊死性細胞死で、このような神経細胞における虚血や興奮毒性、ラーグによって生成されるようにeは、マトリックスカルシウムに難規制増加は、内膜の細孔の開口部、ミトコンドリア透過性遷移孔またはMPTPに貢献しています。これは、内膜を脱分極と外膜の破裂、プロアポトーシス因子の放出、代謝機能不全に貢献する、浸透シフトを引き起こす。のBcl-xLの7を含む多くのタンパク質は、その機能を調節する、F1FO ATP合成酵素と相互作用する。 BCL-XLはF1FO ATP合成酵素のβサブユニットと直接相互作用し、この相互作用はF1FO ATPase活性8中F1FOによってH +の正味の輸送を増加させる、F1FOATPasecomplex内に漏れコンダクタンスを減少させ、それによってミトコンドリアの効率を高める。 ATP合成酵素の活性及び変調を研究するために、我々はF1FO ATPアーゼを含む齧歯類の脳亜ミトコンドリアの小胞（SMVs）から分離された。 Alavian らに示されているようにSMVsはF1FO ATPアーゼの構造および機能の完全性を維持する。ここでは、方法が記載さ我々は、ラット脳からSMVsを単離するために正常に使用していると我々はSMVsのチャネル活性を分析するためのパッチクランプ法（イオンリークコンダクタンス）を描くこと。

我々のプロトコルの最初のステップは、 図1のウェスタンブロットにより示されるようにミトコンドリアの単離精製を可能にする。 図2に脳由来亜ミトコンドリアのベシクルパッチ記録の一例を示している。インサイドアウトパッチ構成を用いて、我々は、ATPによって変調されたチャネルの活性を示す。コントロール（CTL）記録（左）は平均で600 psのピークコンダク?...

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F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

ラット脳からF1FO ATP合成酵素複合体に富む亜ミトコンドリアの小胞を単離する方法が記載されている。これらの小胞はパッチクランプ記録の技術を使用してF1FO ATPアーゼ複合体の活性の研究とその変調を可能にする。

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub亜ミトコンドリアの小胞膜のパッチクランプ記録を実行するための&gt; ATPアーゼ小胞の準備とテクニック

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

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Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...