Name: f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00
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1. Cérebro mitocondrial Isolation (Adaptado de Brown MR et al. 9) <ol><li> Sacrificar o rato usando métodos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). </li><li> Corte a cabeça do animal por decapitação, cortar a pele e expor o crânio. </li><li> Abra o crânio delicadamente cortando com uma tesoura ou rongeur. Remover o cérebro. </li><li> Picar finamente o cérebro sem cerebelo em tampão de isolamento (ver Tabela 1) e transferi-lo para a 5 ml de vidro...

<ol>
	<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease.">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li><li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis,+autophagy+and+control+of+metabolism.">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).</li><li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit.">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li><li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+ATP+synthase:+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits.">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li><li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bcl-2+family:+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis.">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li><li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+proteins:+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis.">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li><li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li><li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities.">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li><li>Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+Synthasomes.">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li></ol>

Os métodos aqui descritos permitem o isolamento de mitocôndrias puro no fim da etapa 1 e vesículas (submitocondriais SMVs) após a etapa 2 a partir de cérebro inteiro sem distinção de célula phenotypes.SMVspurified por este método são essencialmente isentos de contaminação por outros organelos subcelulares, como mostrado na A Figura 1 e o nosso trabalho anterior (Alavian KN et al. 8) e mantêm a sua integridade estrutural e funcional antes da congelação. Após congelaç?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle</td>
 <td>Krackeler Scientific, Inc.</td>
 <td>1-7725T-5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5424 000.410</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4639 Cell Disruption Vessel</td>
 <td>Parr Instrument Company</td>
 <td>4639</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F5415</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>P20314</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SW-50.1 rotor </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L8-70M Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5628 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lubrol PX (C12E9) </td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>205534</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axopatch 200B </td>
 <td>Axon Instruments </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1440A </td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp10.0</td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulator</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capillary</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1308325</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes

As mitocôndrias são envolvidos em várias funções celulares importantes incluindo o metabolismo, uma sobrevivência, desenvolvimento e, a sinalização de cálcio 2. Duas das mais importantes funções mitocondriais estão relacionadas com a produção eficiente de ATP, a moeda de energia da célula, pela fosforilação oxidativa, e na mediação de sinais para a morte programada das células 3. A enzima primariamente responsável pela produção de ATP é a F1FO-ATP sintase, também chamada ATP sintase 4-5. Nos últimos anos, o papel da mitocôndria na morte celular por apoptose e necrose tem recebido uma atenção considerável. Na morte celular por apoptose, Bcl-2, tais como as proteínas da família Bax entrar na membrana mitocondrial externa, e oligomerizar permeabilizar a membrana externa, libertando factores pró-apoptóticos para o citosol 6. Na morte celular necrótica clássico, tal como a produzida por isquemia ou excitotoxicidade em neurónios, um large, aumento pouco regulada em matriz de cálcio contribui para a abertura de um poro da membrana interior, a poro de transição da permeabilidade mitocondrial ou PTPm. Este despolariza a membrana interna e provoca deslocamentos osmóticos, contribuindo para a ruptura da membrana externa, a libertação de factores pró-apoptóticos e disfunção metabólica. Muitas proteínas, incluindo Bcl-xL 7 interagir com F1FO ATP sintase, modulando a sua função. Bcl-xL, interage directamente com a subunidade beta da sintase ATP F1FO, e esta interacção diminui uma condutância de vazamento dentro do F1FOATPasecomplex, aumentando a rede de transporte de H + por F1FO durante F1FO ATPase 8 e aumentando assim a eficiência mitocondrial. Para o estudo da atividade e modulação da ATP sintase, que isolado do cérebro de roedores submitocondriais vesículas (SMVs) contendo F1FO ATPase. Os SMVs manter a integridade estrutural e funcional do F1FO ATPase como mostrado na Alavian et ai. Aqui, nós descrevemos um métodoque temos utilizado com sucesso no isolamento de SMVs de cérebro de rato e delinear a técnica de patch clamp para analisar a actividade de canal (ião vazamento condutância) dos SMVs.

O primeiro passo do nosso protocolo permite o isolamento de mitocôndrias purificadas como mostrado por Western blot na figura 1. Na Figura 2 é mostrado um exemplo de uma gravação de remendo vesícula submitocondriais derivado do cérebro. Usando a configuração de patch de dentro para fora, demonstramos a atividade do canal modulado pela ATP. O controle (CTL) de gravação (esquerda) mostra a atividade multi-canal de condutância com uma condutância pico de 600 pS em média. que f...

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F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Um método para isolar vesículas submitocondriais enriquecidas em F1FO ATP sintase a partir de complexos de cérebro de rato é descrito. Essas vesículas permite o estudo da actividade de F1FO complexo ATPase ea sua modulação por meio da técnica de gravação de patch clamp.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; Ó</sub&gt; ATPase Vesicle Preparação e Técnica para Execução de Remendo Recordings Grampo de membranas de vesículas submitocondriais

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

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