Name: f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes at JoVE.com

1. Мозг митохондриальной Изоляция (адаптировано из Браун MR и др.. 9) <ol><li> Жертвоприношение крысы с использованием методов одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC). </li><li> Отрежьте голову животного путем обезглавливания, порезать кожу и выставит...

<ol>
	<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease.">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li><li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis,+autophagy+and+control+of+metabolism.">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).</li><li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit.">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li><li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+ATP+synthase:+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits.">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li><li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bcl-2+family:+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis.">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li><li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+proteins:+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis.">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li><li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li><li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities.">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li><li>Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+Synthasomes.">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li></ol>

Описанные здесь способы включить выделение чистой митохондрий в конце стадии 1 и субмитохондриальных везикулы (SMVs) после шага 2 от всего головного мозга без различия клетки phenotypes.SMVspurified этим методом, по существу свободный от загрязнения другими субклеточные органеллы, как показано <stron...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle</td>
 <td>Krackeler Scientific, Inc.</td>
 <td>1-7725T-5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5424 000.410</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4639 Cell Disruption Vessel</td>
 <td>Parr Instrument Company</td>
 <td>4639</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F5415</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>P20314</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SW-50.1 rotor </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L8-70M Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5628 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lubrol PX (C12E9) </td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>205534</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axopatch 200B </td>
 <td>Axon Instruments </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1440A </td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp10.0</td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulator</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capillary</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1308325</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes

Митохондрии участвуют во многих важных клеточных функций, включая метаболизм, выживание 1, развитие и, кальциевой сигнализации 2. Два из наиболее важных функций митохондрий связаны с эффективного производства АТФ, энергия валюты из клетки, по окислительного фосфорилирования, и посредством сигналов запрограммированной клеточной смерти 3. Фермент в первую очередь отвечает за производство АТФ F1FO-АТФ-синтазы, которая также называется АТФ-синтазы 4-5. В последние годы, роль митохондрий в апоптозе и некротической гибели клеток получила значительное внимание. В апоптоза, BCL-2 семьи белки, такие как Bax введите митохондриальные наружной мембраны, олигомеризоваться и проницаемыми внешнюю мембрану, высвобождая проапоптотические факторов в цитозоль 6. В классическом некротической гибели клеток, такие как отходы ишемии или эксайтотоксичностью в нейронах, крупе, плохо регулируется увеличение матрицы кальций способствует открытию внутреннего пор мембраны, митохондриальных пор переход проницаемости или МРТР. Это деполяризует внутренней мембраны и вызывает осмотические сдвиги, способствующие разрыву внешней мембраны, выпуск проапоптотические факторы и метаболические дисфункции. Многие белки, включая Bcl-XL 7 F1FO взаимодействовать с АТФ-синтазы, модулирующей функции его. Bcl-X L непосредственно взаимодействует с бета-субъединицы АТФ-синтазы F1FO, и это взаимодействие уменьшается утечка проводимость в F1FOATPasecomplex, увеличение чистой переноса Н + на F1FO в течение F1FO АТФазы 8 и тем самым увеличивая митохондриальной эффективности. Для изучения активности и модуляция АТФ-синтазы, мы изолированы от грызунов мозговых пузырей субмитохондриальных (SMVs), содержащий F1FO АТФазы. SMVs сохранить структурную и функциональную целостность F1FO АТФазы, как показано на Alavian соавт. Здесь мы описываем способчто мы успешно используется для изоляции SMVs из мозга крысы, и мы разграничить технику патч зажим для анализа активности канала (ионная проводимость утечки) из SMVs.

Первым шагом нашего протокола позволяет изолировать очищенной митохондрии, как показано методом вестерн-блоттинга на рисунке 1. На фиг.2 показан пример полученного из головного мозга субмитохондриальных записи патч везикул. Использование наизнанку патч конфигураци...

Watch this Scientific Journal Video about F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes at JoVE.com

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Способе выделения пузырьков субмитохондриальных обогащенный F1FO АТФ-синтазы комплексов из мозга крысы описано. Эти пузырьки позволяют изучение активности АТФазы F1FO комплекса и его модуляции с использованием техники записи патч зажима.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; АТФазы Подготовка пузырька и техника исполнительских патч зажим Записи субмитохондриальных мембран везикул

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Патч зажим Recordings от мыши нейронов сетчатки в темно-адаптированной фрагмент подготовка

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Парные Patch Clamp Recordings от Мотор-нейрон и целевые скелетных мышц в данио рерио

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Культивирование и электрофизиологии ячеек на NRCC Патч зажим фишки

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Записи в внутренних волосковых клеток уха, изолированных от данио рерио

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Выделение сенсорных нейронах<em&gt; Aplysia саЩогтса</em&gt; Для патч зажим Recordings глутаматергической Токи

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Патч зажим Recordings от эмбриональных данио рерио Mauthner клеток

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Электрофизиологических и морфологических характеристик нейронов микросхем при остром мозга срезов при использовании парных патч-зажим Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Цельноклеточной патч-зажим Записи в головном мозге Ломтики

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Субклеточные патч-зажим Recordings от Somatodendritic домена нигральных дофамина нейронами

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...