Name: f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes at JoVE.com

Ett. Brain Mitokondriell Isolering (Anpassat från Brown MR et al. 9) <ol><li> Offra råttan med metoder som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). </li><li> Skär huvudet av djuret genom halshuggning, skära in i huden och exponera skallen. </li><li> Öppna skallen försiktigt genom att klippa med sax eller rongeur. Ta bort hjärnan. </li><li> Finhacka fint hjärnan utan lillhjärnan i Isolation Buffer (se tabell 1) och för över det till en 5 ...

<ol>
	<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival.">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li><li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease.">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li><li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis,+autophagy+and+control+of+metabolism.">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, S31-S37 (2007).</li><li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit.">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li><li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+ATP+synthase:+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits.">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li><li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bcl-2+family:+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis.">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li><li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+proteins:+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis.">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li><li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase.">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li><li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities.">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li><li>Young, H. K. o., Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+Synthasomes.">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li></ol>

De metoder som beskrivs häri möjliggör isolering av rent mitokondrier vid slutet av steg 1 och submitochondrial vesiklar (SMVs) efter steg 2 från hela hjärnan utan åtskillnad av cell phenotypes.SMVspurified genom denna metod är i huvudsak fri från föroreningar av andra subcellulära organeller, såsom visas i Figur 1 och vårt tidigare arbete (Alavian KN et al. 8) och bibehåller sin strukturella och funktionella integritet före frysning. Efter frysning och upptining, isole...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle</td>
 <td>Krackeler Scientific, Inc.</td>
 <td>1-7725T-5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eppendorf Centrifuge 5424 </td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5424 000.410</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4639 Cell Disruption Vessel</td>
 <td>Parr Instrument Company</td>
 <td>4639</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ficoll</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F5415</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polycarbonate centrifuge tubes</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>P20314</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SW-50.1 rotor </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L8-70M Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digitonin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5628 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lubrol PX (C12E9) </td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>205534</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Axopatch 200B </td>
 <td>Axon Instruments </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Digidata 1440A </td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pClamp10.0</td>
 <td>Molecular Device</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulator</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capillary</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1308325</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87</td>
 <td>Sutter Instrument</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

f1fo atpase vesicle preparation and technique for performing patch clamp recordings of submitochondrial vesicle membranes

Mitokondrier är inblandade i många viktiga cellulära funktioner inklusive metabolism, överlevnad 1, utveckling och, kalcium signalering 2. Två av de viktigaste mitokondriella funktioner är relaterade till effektiv produktion av ATP, den energi valuta i cellen, genom oxidativ fosforylering, och förmedling av signaler för programmerad celldöd 3. Enzymet primärt ansvarig för produktionen av ATP är den F1FO-ATP-syntas, även kallad ATP-syntas 4-5. Under de senaste åren har betydelsen av mitokondrier i apoptotiska och nekrotiska celldöd fått stor uppmärksamhet. I apoptotiska celldöd, BCL-2 familjen proteiner såsom Bax in den mitokondriella yttre membranet, oligomerisera och permeabilize yttre membran, släpper proapoptotiska faktorer i cytosolen 6. I klassisk nekrotisk celldöd, såsom den som produceras av ischemi eller excitotoxicitet i nervceller, en large, dåligt reglerade ökning matrix kalcium bidrar till öppnandet av ett inre membran por, den mitokondriella permeabilitet övergången pore eller MPTP. Detta depolariserar det inre membranet och orsakar osmotiska skift, bidrar till yttre membran bristning, frisättning av pro-apoptotiska faktorer, och metabolisk dysfunktion. Många proteiner innefattande Bcl-Xl 7 interagerar med F1FO ATP-syntas, modulera dess funktion. Bcl-xL interagerar direkt med betasubenheten av F1FO ATP-syntas, och denna interaktion minskar läckage konduktans inom F1FOATPasecomplex, ökar netto transport av H + från F1FO under F1FO ATPas aktivitet 8 och därigenom öka mitokondriell effektivitet. Att studera aktiviteten och modulering av ATP-syntas, isolerade vi från submitochondrial gnagare hjärnan blåsor (SMVs) innehåller F1FO ATPas. De SMVs bibehåller den strukturella och funktionella integriteten hos F1FO ATPas såsom visas i Alavian et al. Här beskriver vi en metodatt vi har framgångsrikt använts för att isolera SMVs från råtthjärna och vi avgränsa tekniken patch clamp att analysera kanal aktivitet (jon läcka konduktans) av SMVs.

Det första steget i vår protokoll möjliggör för isolering av renade mitokondrier såsom visas med Western blöt i figur 1. I figur 2 visas ett exempel på en hjärnhärledd submitochondrial vesikel patch inspelning. Använda inside-out patch konfiguration vi visar kanal aktivitet moduleras av ATP. Kontrollen (CTL) inspelning (vänster) visar flera konduktans kanal aktivitet med en topp konduktans av 600 pS i genomsnitt. som omedelbart minskade vid tillsats av 1 mM ATP till badet. D...

Watch this Scientific Journal Video about F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes at JoVE.com

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

En metod för att isolera submitochondrial vesiklar anrikade i F1FO ATP-syntas-komplex från råtthjärna beskrivs. Dessa blåsor tillåter studier av aktiviteten hos F1FO ATPas komplex och dess modulering användning av tekniken med patch clamp inspelning.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPas vesikelberedning och teknik for Performing Patch Clamp Inspelningar av Submitochondrial Blås Membran

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Inspelningar från mus näthinnan nervceller i en anpassad Dark-Slice Förberedelser

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Kopplade Patch Clamp Inspelningar från Motor-neuron och Target skelettmuskulaturen i Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Odling och Elektrofysiologi av celler på NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp inspelningar i Inre celler öronhår isolerad från Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

Isolering av sensoriska neuroner av<em&gt; Aplysia californica</em&gt; För Patch Clamp Inspelningar av glutamaterg Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Inspelningar från embryonala Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Hel-cell Patch-clamp Inspelningar från Morphologically- och neurokemiskt identifierade Hippocampus Interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro och morfologisk karakterisering av neurala Microcircuits i akut hjärnan skivor Använda Kopplade Patch-Clamp Inspelningar

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellulära Patch-clamp inspelningar från somatodendritisk området nigrala dopaminneuroner

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...