Name: mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Evan Newell og Dr. Sean Bendall for feedback. Vi vil også gerne takke DVS Sciences og Dr. Sean Bendall for et udsnit af de Multi-lanthanid-holdige polystyrenperler. Vi er taknemmelige for støtte fra NIH tilskud 2 U19 AI057229.

Alle celleprøver for CyTOF skal fastsættes og permeabiliseres. Dette giver mulighed for bedre adgang for iridium-holdige DNA-interkalator, og forhindrer også cellelysis i MilliQ vand vask og resuspension trin umiddelbart før injektion i massen cytometeret. 1. Opstart af Mass Cytometer <ol><li> Åbn det CyTOF softwareprogram. Vælg Instrument Setup. På kortbåsen fanen, skal du gå til det nederste højre hjørne og klik Heater &quot;ON&quot; knappen. Tænd ovnen på mindst 15 minutter...

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

I de sidste årtier er fluorescens-flow-cytometri er en arbejdshest fremgangsmåde til analyse af enkelte celler, både med hensyn til overfladeekspression og i funktionelle assays. Imidlertid har spørgsmål vedrørende spektral overlapning af de fluorescerende farvestoffer begrænset antallet af samtidige markører. Mens forsøg med mere end 12 samtidige markører er blevet rapporteret, at kompensationsbeløbet nødvendig gør dette teknisk vanskeligt. I stedet for fluoroforer, masse-cytom...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CyTOF TM masse cytometeret </td><td> DVS Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vask løsning </td><td> DVS Sciences </td><td> 201.071 </td><td> 0,05% flussyre i vand </td></tr><tr><td> Tuning løsning </td><td> DVS Sciences </td><td> 201.072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, spor salpetersyre </td></tr><tr><td> Eu-holdige polystyrenperler </td><td> DVS Sciences </td><td> 201.073 </td><td> Indeholder naturlige overflod Eu isotoper perler leveres på omkring 1 mio / ml </td></tr><tr><td> Multi-lanthanid-holdige (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polystyrenperler </td><td> DVS Sciences </td><td> Endnu ikke kommercielt tilgængelige </td><td> Indeholder naturlige overflod isotoper af børsnoterede lanthanider </td></tr><tr><td> Salpetersyre (koncentreret) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima trace-metal pure ICP-MS grad </td></tr><tr><td> Polystyren rundbundet rør med celle-si cap-5ml_ </td><td> BD </td><td> 352.235 </td><td> bruges til at filtrere celleprøver før injektionen </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin sprøjte-1ml_ </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010-200V0 </td><td> silikone-fri, latex-fri </td></tr><tr><td> Norm-Ject sprøjte-3 mL </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010.000V0 </td><td> silikone-fri, latex-fri </td></tr><tr><td> MilliQ vand </td><td></td><td></td><td> 18 MOhm rent vand, må ikke opbevares i glas-eller plastflasker, der er blevet vasket med kommercielt detergent (som følge af deres høje barium stede). </td></tr><tr><td> Cit.ranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> acid detergent </td></tr><tr><td> Argongas </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% Ultra-høj renhed </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

I de senere år har den hurtige analyse af enkelte celler, der normalt blevet udført under anvendelse af flowcytometri og fluorescens-mærkede antistoffer. Imidlertid har spørgsmålet om spektral overlapning af fluorofor-emission begrænset antallet af samtidige prober. I modsætning hertil, den nye CyTOF masse cytometer af DVS Sciences par en flydende encellede introduktion system til et ICP-MS. En stedet for fluoroforer er chelaterende polymerer indeholdende højt-beriget metal isotoper koblet til antistoffer eller andre specifikke prober. 2-5 På grund af metal renhed og masse opløsning af massen cytometeret, er der ingen &quot;spektral overlapning&quot; fra tilstødende isotoper, og derfor ikke behov for kompensation matricer. Desuden, på grund af anvendelsen af ​​lanthanidmetaller, der er ingen biologisk baggrund og derfor ikke ækvivalent autofluorescens. Med en masse vindue spænder atommasse 103-203, teoretisk op til 100 etiketter kunne skelnes samtidigt. For øjeblikket, Mere end 35 kanaler er tilgængelige ved hjælp af chelaterende reagenser fås fra DVS Sciences, giver en hidtil uset dissektion af den immunologiske profil af prøver. 6-7 Ulemper masse cytometri omfatter strenge krav om et særskilt metal isotop pr probe (ikke svarer til fremad eller sidespredning), og at det er en destruktiv teknik (ingen mulighed for sortering recovery). Den aktuelle konfiguration af massen cytometer har også en celle transmission på kun ~ 25%, og det kræver et højere input antal celler. Optimal daglig ydeevne masse cytometeret kræver flere trin. Det grundlæggende mål for optimering er at maksimere det målte signal intensiteten af ​​det ønskede metal-isotoper (M) og samtidig minimere dannelsen af ​​oxider (M +16), som vil reducere M signalintensitet og forstyrre enhver ønsket signal på M 16. Det første trin er at varme op maskinen, så en varm, stabilt ICP plasma er blevet etableret. For det andet skal indstillingerne for nuværende og make-up gasstrømningshastighed optimeres på daglig basis. Under prøveindsamling, er den maksimale celle begivenhed hastighedsbegrænset af detektor effektivitet og forarbejdning hastighed til 1000 celler / sekund. Men afhængigt af prøvens kvalitet, en langsommere celle hændelsesrate (300-500 celler / sekund) er sædvanligvis ønskeligt at gøre det muligt bedre opløsning mellem celler begivenheder og således maksimere intakte singletter løbet dubletter og nedbrudt materiale. Endelig passende rensning af maskinen ved slutningen af ​​dagen til at minimere baggrundssignal som følge af frit metal.

Efter ovennævnte protokol skal udrette fire ting. For det første vil tillade tilstrækkelig opvarmningstid for massen cytometer frembringe en varm, stabilt plasma nødvendige for optimal signal og minimal oxiddannelse. For det andet, passende vask af massen cytometeret med MilliQ vand og DVS vaskeopløsningen (figur 9) vil bidrage til at mindske niveauerne af metal adsorption til røret og andre dele af maskinen, hvilket hjælper til at reducere baggrunden under prøveindsamling (figur 8).</st...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

De nødvendige skridt til daglig tuning og optimering af udførelsen af ​​en CyTOF masse cytometer er beskrevet. Kommentarer til optimal prøveforberedelse og strømningshastighed diskuteres

Mass Cytometry: Protokol for Daily Tuning og Running celleprøver på en CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Ekstraktion for målrettet stabile isotoper Fortynding Liquid Chromatography-massespektrometri Analyse

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field Fluorescent Microscopy og Fluorescerende Imaging Flowcytometri på en Cell-telefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Imaging af biologisk væv ved Desorption elektrosprayionisering massespektrometri

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning på fotolitografisk Defineret Parylene-C: SiO<sub&gt; 2.</sub&gt; Underlag

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Prøve Forberedelse Strategier for massespektrometri Imaging af 3D cellekulturmodeller

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolering af primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske Væv og Dyrkning dem direkte på Soft Elastic Substrater for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

En protokol til bioinspirerede Design: En Ground Sampler Baseret på Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...