Name: mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Nous tenons à remercier le Dr Evan Newell et le Dr Sean Bendall des commentaires. Nous tenons également à remercier Sciences DEP et le Dr Sean Bendall pour un échantillon de billes de polystyrène multi-lanthanide contenant. Nous sommes reconnaissants pour le financement du NIH subvention de 2 U19 AI057229.

Tous les échantillons cellulaires pour la CyTOF doivent être fixées et perméabilisées. Cela permet une plus grande entrée de la intercalant d&#39;ADN contenant de l&#39;iridium, et empêche également la lyse des cellules pendant le lavage de l&#39;eau MilliQ et des mesures de remise en suspension immédiatement avant l&#39;injection dans le cytomètre de masse. 1. Démarrage de la cytomètre de masse <ol><li> Ouvrez le logiciel CyTOF. Sélectionnez Configuration de l&#39;instrument....

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Pour les dernières décennies, la cytométrie en flux par fluorescence a été une méthode bourreau de travail pour l&#39;analyse de cellules uniques, à la fois en termes d&#39;expression de surface et dans des tests fonctionnels. Cependant, les problèmes de chevauchement spectrales des colorants fluorescents a limité le nombre de marqueurs simultanées. Bien que les expériences qui utilisent plus de 12 marqueurs simultanées ont été signalés, le montant de la compensation nécessaire en fait techniquement diff...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> CyTOF TM masse cytomètre </td><td> Sciences DVS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solution de lavage </td><td> Sciences DVS </td><td> 201071 </td><td> 0,05% d&#39;acide fluorhydrique dans de l&#39;eau </td></tr><tr><td> Tuning solution </td><td> Sciences DVS </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace d&#39;acide nitrique </td></tr><tr><td> Des billes de polystyrène contenant de l&#39;UE </td><td> Sciences DVS </td><td> 201073 </td><td> Contient naturelle de l&#39;abondance des isotopes de l&#39;UE; perles fournis à environ 1 million / ml </td></tr><tr><td> Multi-lanthanide contenant (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - billes de polystyrène </td><td> Sciences DVS </td><td> Pas encore disponible dans le commerce </td><td> Contient naturelle de l&#39;abondance des isotopes de lanthanides cotées </td></tr><tr><td> L&#39;acide nitrique (concentré) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima oligo-métal pur ICP-MS de qualité </td></tr><tr><td> Polystyrène à fond rond tube avec crépine cellule-cap-5mL </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> utilisé pour filtrer des échantillons de cellules avant l&#39;injection </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin seringue de 1 ml </td><td> Henke Sass Loup </td><td> 4010-200V0 </td><td> sans silicone, sans latex </td></tr><tr><td> Norm-Ject seringue 3 ml </td><td> Henke Sass Loup </td><td> 4010.000V0 </td><td> sans silicone, sans latex </td></tr><tr><td> De l&#39;eau MilliQ </td><td></td><td></td><td> Eau de 18 MQ pur; ne doivent pas être stockés dans bouteilles en verre ou en plastique qui ont été lavés avec un détergent commercial (en raison de leurs niveaux élevés de présence de baryum). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> détergent acide </td></tr><tr><td> Gaz argon </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% ultra haute pureté </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

Ces dernières années, l&#39;analyse rapide de cellules individuelles a souvent été réalisée en utilisant la cytométrie en flux et des anticorps à marquage fluorescent. Toutefois, la question du chevauchement spectral d&#39;émission des fluorophores a limité le nombre de sondes simultanées. En revanche, le cytomètre de masse nouvelle CyTOF par des couples Sciences DVS un système d&#39;introduction de liquide à cellule unique à un ICP-MS. 1 Plutôt que de fluorophores, les polymères chélateurs métalliques contenant des isotopes hautement enrichi sont couplés à des anticorps ou d&#39;autres sondes spécifiques 2-5. En raison de la pureté du métal et de la résolution en masse du cytomètre de masse, il n&#39;existe pas de &quot;chevauchement spectral&quot; des isotopes voisins, et donc pas de nécessité pour les matrices de compensation. De plus, en raison de l&#39;utilisation de métaux lanthanides, il n&#39;y a pas d&#39;arrière-plan biologique et donc pas d&#39;équivalent de l&#39;autofluorescence. Avec une fenêtre de masse couvrant masse atomique 103-203, théoriquement jusqu&#39;à 100 étiquettes peuvent être distingués en même temps. Actuellement, Plus de 35 chaînes sont disponibles en utilisant les réactifs chélateur disponible à partir Sciences DVS, ce qui permet une dissection sans précédent du profil immunologique des échantillons. 6-7 Inconvénients de la cytométrie de masse comprennent l&#39;exigence stricte d&#39;un isotope métallique séparé par la sonde (pas d&#39;équivalent de la diffusion vers l&#39;avant ou sur le côté), et le fait qu&#39;il s&#39;agit d&#39;une technique destructrice (pas de possibilité de tri de récupération). La configuration actuelle du cytomètre de masse a également un taux de transmission de cellules de seulement ~ 25%, ce qui nécessite un nombre élevé de cellules d&#39;entrée. Optimal performance quotidienne de l&#39;cytomètre de masse nécessite plusieurs étapes. L&#39;objectif de base de l&#39;optimisation est de maximiser l&#39;intensité du signal mesuré des isotopes métalliques désirés (M), tout en minimisant la formation d&#39;oxydes (+16 M) qui va diminuer l&#39;intensité du signal M et interférer avec un signal désiré à M +16. La première étape consiste à chauffer la machine pour un climat chaud et stable, jeCP plasma a été mis en place. Deuxièmement, les paramètres de débit de gaz actuelle et le maquillage doit être optimisée sur une base quotidienne. Lors de la collecte de l&#39;échantillon, le taux cellulaire maximale événement est limitée par l&#39;efficacité du détecteur et de la vitesse de traitement de 1000 cellules / seconde. Toutefois, en fonction de la qualité de l&#39;échantillon, un taux plus lent cellule événement (300-500 cellules / seconde) est généralement souhaitable de permettre une meilleure résolution entre les événements cellules et donc de maximiser maillots intactes au cours des doublets et des débris. Enfin, un nettoyage adéquat de la machine à la fin de la journée contribue à réduire le signal de fond en raison de métal libre.

En suivant le protocole ci-dessus doivent accomplir quatre choses. Tout d&#39;abord, permettant échauffement adéquat du temps pour le cytomètre de masse produira une chaude, plasma stable nécessaire pour un signal optimal et la formation de l&#39;oxyde minime. Deuxièmement, lavage adéquat du cytomètre de masse avec de l&#39;eau MilliQ et la solution de lavage DVS (figure 9) aidera à réduire les niveaux de métal d&#39;adsorption à la tubulure et d&#39;autres parties de la machine, en aidant à...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Les mesures nécessaires pour la syntonisation par jour et d&#39;optimisation de la performance d&#39;un cytomètre de masse CyTOF sont décrits. Commentaires sur la préparation optimale de l&#39;échantillon et le débit sont discutés

Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Caractériser Volatiles bactérienne secondaire à l&#39;aide d&#39;ionisation électrospray spectrométrie de masse (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Recherche

Bio-ingénierie

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Un protocole simple Hanging culture cellulaire pour la production chute de sphéroïdes 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

L&#39;extraction des lipides cellulaires pour ciblées dilution isotopique stable analyse de spectrométrie de masse chromatographie liquide-

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Champ large Microscopie fluorescente et cytométrie de flux fluorescente imagerie sur un téléphone portable

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolation des droits de cellules primaires de tumeurs du côlon à partir de tissus chirurgicaux et les cultivant directement sur élastique souple substrats pour Traction cytométrie

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Un protocole pour bioinspirée Conception: Rez-de-Sampler Basé sur Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

Corps entier Spectrométrie de masse d&#39;imagerie par infrarouge laser assistée par matrice désorption Electrospray Ionisation (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...