Name: mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Vi ønsker å takke dr. Evan Newell og Dr. Sean Bendall for tilbakemelding. Vi vil også takke DVS Sciences og Dr. Sean Bendall for et utvalg av Multi-lanthanid-holdige polystyren perler. Vi er takknemlige for støtte fra NIH stipend to U19 AI057229.

Alle celleprøver for CyTOF må være fast og permeabilized. Dette muliggjør større oppføring av iridium-holdige DNA intercalator, og forhindrer også cellelyse under MilliQ vannvask og resuspendering trinnene umiddelbart før injisering inn i massen cytometeret. 1. Oppstart av Mass cytometeret <ol><li> Åpne CyTOF programmet. Velg Instrument Setup. På kortet Cage kategorien, går du til nedre høyre hjørne og klikk Heater &quot;ON&quot;-knappen. Slå på varmeapparatet minst 15 min f...

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

For de siste tiårene, har fluorescens flowcytometri vært en arbeidshest metode for å analysere enkeltceller, både i form av overflate uttrykk og i funksjonelle analyser. Imidlertid har problemene med spektrale overlapping av de fluorescerende fargestoffer begrenset antallet samtidige markører. Mens forsøk med mer enn 12 samtidige markører er rapportert, gjør erstatningsbeløpet nødvendig dette teknisk vanskelig. Istedenfor fluoroforer, masse cytometri utviklet av DVS Sciences bruker...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navnet på reagensen </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> CyTOF TM masse cytometer </td><td> DVS Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vask løsning </td><td> DVS Sciences </td><td> 201071 </td><td> 0,05% flussyre i vann </td></tr><tr><td> Tuning løsning </td><td> DVS Sciences </td><td> 201072 </td><td> 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, sporstoffer salpetersyre </td></tr><tr><td> Eu-holdige polystyrenkuler </td><td> DVS Sciences </td><td> 201073 </td><td> Inneholder naturlig overflod Eu isotoper; perler levert på ca 1 mill / ml </td></tr><tr><td> Multi-lanthanid-holdige (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polystyrenkuler </td><td> DVS Sciences </td><td> Ennå ikke kommersielt tilgjengelig </td><td> Inneholder naturlig overflod isotoper av børsnoterte lanthanider </td></tr><tr><td> Salpetersyre (konsentrert) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima spor-metal ren ICP-MS grade </td></tr><tr><td> Polystyren rundbunnet rør med celle-sil cap-5ml </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> brukes til å filtrere celleprøver før injeksjon </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin sprøyte-1mL </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010-200V0 </td><td> silikon-fri, latex-fri </td></tr><tr><td> Norm-Ject sprøyte-3 ml </td><td> Henke Sass Wolf </td><td> 4010.000V0 </td><td> silikon-fri, latex-fri </td></tr><tr><td> MilliQ vann </td><td></td><td></td><td> 18 MΩ rent vann, må ikke oppbevares i glass eller plast flasker som har blitt vasket med oppvaskmiddel (på grunn av deres høye nivåer av barium tilstede). </td></tr><tr><td> CITranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> surt rengjøringsmiddel </td></tr><tr><td> Argongass </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% ultrahøy renhet </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

I de senere årene har den raske analyse av enkeltceller ofte blitt utført ved hjelp av flowcytometri og fluorescently-merkede antistoffer. Imidlertid har problemet med spektrale overlapping av fluorofor utslipp begrenset antallet samtidige sonder. I kontrast til nye CyTOF massen cytometer etter DVS Sciences par flytende encellet introduksjon system til en ICP-MS. 1 stedet fluoroforer er chelaterende polymerer inneholdende høyt anrikede isotoper metal koplet til antistoffer eller andre spesifikke sonder. 2-5 På grunn av metall renhet og masse oppløsning av massen cytometeret, er det ingen &quot;spektral overlapping&quot; fra nærliggende isotoper, og derfor ikke behov for kompensasjon matriser. Tillegg, på grunn av bruken av lantanid metaller, er det ingen biologisk bakgrunn og derfor ingen ekvivalent autofluorescens. Med en masse vindu spanning atommasse 103-203, teoretisk opptil 100 etiketter kunne skilles samtidig. I dag, Mer enn 35 kanaler er tilgjengelige via chelaterende reagenser tilgjengelig fra DVS Sciences, slik enestående disseksjon av den immunologiske profilen av prøver. 6-7 Ulemper for massen cytometri inkludere strenge nødvendig med en separat metall isotop pr probe (ingen tilsvarer fremover eller sidespredning), og det faktum at det er en destruktiv teknikk (ingen mulighet for sortering utvinning). Gjeldende konfigurasjon av massen cytometeret har også en celle overføringshastighet på bare ~ 25%, og dermed krever et høyere inngang antall celler. Optimal daglig ytelse av massen cytometeret krever flere trinn. Grunnleggende mål av optimaliseringen er å maksimere den målte signalintensitet av de ønskede isotoper metal (M) samtidig minimere dannelsen av oksider (M 16) som vil redusere M signalintensitet og forstyrre ønsket signal på M 16. Det første trinnet er å varme opp maskinen slik at en varm, stabil jegCP plasma er etablert. Sekund, må innstillingene for strøm og make-up gass strømningshastighet bli optimalisert på en daglig basis. Under prøvetaking, er den maksimale celle hendelsesraten begrenset av detektoren effektivitet og prosesseringshastighet til 1000 celler / andre. Imidlertid, avhengig av prøven kvalitet, en langsommere celle hendelsesrate (300-500 celler / sekund) er vanligvis ønskelig for å tillate bedre oppløsning mellom celler hendelser og dermed maksimere intakte singlets løpet dubletter og rusk. Slutt hjelper tilstrekkelig rengjøring av maskinen ved slutten av dagen minimere bakgrunnssignal grunnet materialovergang.

Etter ovennevnte protokoll skal oppnå fire ting. Først, vil tillate tilstrekkelig oppvarmingstid for massen cytometeret produsere en varm, stabil plasma nødvendig for en optimal signal og minimal oksyddannelse. Sekund, tilstrekkelig vasking av massen cytometer med MilliQ vann og DVS vaskeoppløsning (figur 9) vil bidra til å redusere nivåene av metall adsorpsjon til slangen og andre deler av maskinen, bidrar til å redusere bakgrunnen under prøvetagning (Figur 8). Det vil også bi...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer at JoVE.com

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

De nødvendige skritt for daglig tuning og optimalisering av ytelsen til en CyTOF masse cytometer er beskrevet. Kommentarer til optimal prøveopparbeidelse og strømningshastighet er diskutert

Mass cytometri: Protokoll for Daily Tuning og kjører celleprøver på en CyTOF Mass cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Uttak for Målrettet Stabil isotopfortynning Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Wide-field fluoriserende mikroskopi og fluoriserende Imaging flowcytometri på en mobiltelefon

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Avbildning av biologisk vev ved Desorpsjon Elektrospray Ionization massespektrometri

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Mønster på Photolithographically Definert Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Underlag

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Prøvepreparering Strategier for massespektrometri Imaging av 3D-Cell Kultur Modeller

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Isolering av primære humane Colon tumorceller fra Kirurgiske vev og dyrking dem direkte på myke, elastiske Underlag for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

En protokoll for Bioinspired Design: En Ground Sampler Basert på Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...