Name: mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Evan Newell e Dr. Sean Bendall para o gabarito. Gostaríamos também de agradecer a DVS Ciências e Dr. Sean Bendall para uma amostra das contas Multi-lantanídeos contendo poliestireno. Estamos gratos pelo financiamento do NIH concessão 2 U19 AI057229.

Todas as amostras de células para a CyTOF devem ser fixadas e permeabilizadas. Isto permite uma maior entrada do intercalador de ADN contendo irídio, e também evita que a lise das células durante a lavagem com água MilliQ e ressuspensão passos imediatamente antes de proceder à injecção no citómetro de massa. 1. Start-up da Citómetro Massa <ol><li> Abra o programa de software CyTOF. Selecione Configuração do instrumento. Na guia do gabinete, ir para o canto inferior direito e c...

<ol>
	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Para as últimas décadas, a citometria de fluxo de fluorescência tem sido um método laborioso para a análise de células individuais, quer em termos de expressão de superfície e em ensaios funcionais. No entanto, os problemas de sobreposição espectral dos corantes fluorescentes tem limitado o número de marcadores em simultâneo. Embora experimentos com mais de 12 marcadores simultâneos têm sido relatados, o montante da compensação necessária torna esta tecnicamente difícil. Em...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CyTOF TM massa citómetro </td><td> DVS Ciências </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lave solução </td><td> DVS Ciências </td><td> 201071 </td><td> 0,05% de ácido fluorídrico em água </td></tr><tr><td> Ajustando solução </td><td> DVS Ciências </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, traço de ácido nítrico </td></tr><tr><td> Ue contêm esferas de poliestireno </td><td> DVS Ciências </td><td> 201073 </td><td> Contém isótopos naturais abundância UE; contas fornecidos em aproximadamente 1 milhão / mL </td></tr><tr><td> Multi-lantanídeos contendo (La / Pr / Tb / TM / Lu) - esferas de poliestireno </td><td> DVS Ciências </td><td> Ainda não disponível comercialmente </td><td> Contém natural abundância de isótopos de lantanídeos listadas </td></tr><tr><td> Ácido nítrico (concentrado) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima-trace metal puro ICP-MS grau </td></tr><tr><td> Tubo de fundo redondo de poliestireno com células coador-cap-5ml </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> usado para filtrar amostras de células antes da injecção </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin seringa-1mL </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010-200V0 </td><td> sem silicone, sem látex </td></tr><tr><td> Norm-Ject-seringa de 3 mL </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010.000V0 </td><td> sem silicone, sem látex </td></tr><tr><td> Água MilliQ </td><td></td><td></td><td> 18 MQ água pura, não deve ser armazenado em garrafas de vidro ou de plástico que foram lavados com detergente comercial (devido a seus altos níveis de presente de bário). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> detergente ácido </td></tr><tr><td> O gás argônio </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% de pureza ultra-elevada </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

Nos últimos anos, a análise rápida de células individuais tem sido normalmente realizadas utilizando a citometria de fluxo por fluorescência e anticorpos marcados. No entanto, a questão da sobreposição espectral de emissões fluoróforo tem limitado o número de sondas simultâneas. Em contraste, o citómetro de nova massa CyTOF por casais DVS Sciences um sistema de introdução de líquido de uma única célula de um ICP-MS. Uma vez de fluoróforos, os polímeros de quelação que contenham os isótopos de metal altamente enriquecidas são acopladas a anticorpos ou outras sondas específicas. 2-5 Devido à pureza do metal e resolução de massa do citómetro de massa, não existe nenhum &quot;sobreposição espectral&quot; de isótopos vizinhos, e, portanto, não há necessidade de matrizes de compensação. Além disso, devido ao uso de metais lantanídeos, não há biológico e, por conseguinte, qualquer equivalente de autofluorescência. Com uma janela de massa estendida massa atómica 103-203, teoricamente até 100 etiquetas podem ser distinguidos simultaneamente. Atualmente, Mais de 35 canais estão disponíveis usando os reagentes quelante disponível a partir de DVS Sciences, permitindo a dissecção sem precedentes do perfil imunológico de amostras. 6-7 Desvantagens para citometria de massa incluem o requisito estrito para um isótopo de metal separado por sonda (nenhum equivalente de dispersão frontal ou lateral), e o facto de que é uma técnica destrutiva (sem possibilidade de separação de recuperação). A actual configuração do citómetro de massa também tem uma taxa de transmissão de células de apenas ~ 25%, o que requer um maior número de células de entrada. Desempenho diário ideal do citômetro de massa requer várias etapas. O objectivo básico da optimização é maximizar a intensidade de sinal de medição dos isótopos de metal desejados (M) ao mesmo tempo minimizando a formação de óxidos (M 16), que irá diminuir a intensidade do sinal M e interferir com qualquer sinal desejado em M 16. O primeiro passo é aquecer a máquina para um quente, eu estávelCP plasma foi estabelecida. Segundo, as definições para a taxa atual e make-up de fluxo de gás deve ser otimizada em uma base diária. Durante a recolha de amostra, a taxa máxima de células evento é limitada pela eficiência do detector e a velocidade de processamento de 1000 células / segundo. No entanto, dependendo da qualidade da amostra, uma taxa mais lenta do evento de células (300-500 células / segundo), é usualmente desejável para permitir uma melhor resolução entre os eventos de células e, assim, maximizar singlets intactas sobre doublets e detritos. Por fim, a limpeza adequada da máquina no fim do dia, ajuda a minimizar o sinal de fundo, devido ao metal livre.

Seguindo o protocolo acima deve realizar quatro coisas. Em primeiro lugar, permitindo que o tempo de aquecimento adequado para o citômetro de massa irá produzir um plasma quente e estável necessário para o sinal ótima e formação de óxido mínimo. Lavagem, segundo adequada do citómetro de massa com MilliQ água e solução de lavagem DVS (Figura 9) vai ajudar a reduzir os níveis de metal de adsorção para a tubagem e outras partes da máquina, ajudando a reduzir o fundo durante a aquisição d...

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Os passos necessários para a sintonização diária e optimização do desempenho de um citómetro de massa CyTOF são descritos. Comentários sobre a preparação da amostra ideal e vazão são discutidos

Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

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