Name: chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לסרטן, CA131967.

1. התאגדות BrdU (סימון מסוף) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט לכ 70% במפגש 24 שעתי 150 מ&quot;מ רקמת תרבות צלחת לפני התוספת של BrdU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף תקשורת עם תקשורת מלאה טריה המכילה 20 מיקרוגרם / המ&quot;ל BrdU (סיגמא) בנקודתי זמן מתאימות לפני ה...

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

הכנת ממרחי כרומוזום היא שלב קריטי להצלחת בדיקת שכפול עיתוי שתואר כאן. הכללתו של צעד מקדים colcemid לפני טיפול hypotonic עשויה לסייע בתדירות ובהפצה של תאי mitotic. אנחנו בדרך כלל לחשוף תאים לcolcemdi עבור 1-3 שעות לפני הקציר, ולהשתמש colcemid בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל. עם זאת, הכללתו ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> הרוש Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 מיקרוגרם / μl </td></tr><tr><td> ניק תרגום קיט </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> ספקטרום אורנג&#39; dUTP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> משתנה </td><td></td></tr><tr><td> חיץ הכלאת LSI / WCP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> חיץ הכלאת CEP </td><td> אבוט מולקולרי (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> כרומוזום פאיNTS </td><td> MetaSystems הקבוצה </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> אולימפוס BX61 מיקרוסקופ פלורסנט </td><td> אולימפוס </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> מערכת תוכנת הדמית מיקרוסקופ </td><td> יישומי הדמיה </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> מצלמה דיגיטלית </td><td> אולימפוס </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> במתכוני כלאה באתר פתרוני פוראמיד 70% Formamide/2x SSC 35 מ&quot;ל פוראמיד * (סיגמא) 10 המ&quot;ל SSC 10x 5 המ&quot;ל ד 2 H 2 0 pH ל -7.0 עם HCl (סיגמא) * חשוב להשתמש פוראמיד כי אוחסן ב -20 ° C. אחסון בטמפרטורת חדר ממושך יפיק חומצה פורמית והחומציות wחולה להיות נמוך מדי. 50% Formamide/2x SSC 25 פוראמיד מ&quot;ל (סיגמה) 10 המ&quot;ל SSC 10x 15 המ&quot;ל DH 2 O pH ל -7.0 עם HCl (סיגמא) 20x SSC, 4 L 702 גרם NaCl (סיגמא) 358 גרם Na ציטראט (סיגמא) DH 2 O לנפח PN מאגר [0.1 מ &#39;NaP0 4 0.1% NP_40 (סיגמא)] הפוך פתרון 0.1 מ &#39;כל אחד פוספט נתרן (המסנן לעקר ולאחסן ב500 aliquots מ&quot;ל). 0.1 מ &#39;Nah 2 P0 4, 1 ליטר 13.8 גרם לאא 2 P0 4 (סיגמא): DH 2 O לנפח 0.1 מ &#39;Nah 2 P0 4 1 ליטר </strאונג&gt; 14.2 גרם לאא 2 P0 4 (סיגמא) DH 2 O לנפח. PN: התאם את ה-pH של 0.1 מ &#39;Na 2 HP0 4 ל-pH 8.0 עם .1 M nah 2 P0 4. סנן לעקר ולהוסיף 1 מ&quot;ל של NP-40. PNM 50 מ&quot;ל 1.25 גר &#39;אבקת חלב ללא שומן (סיגמא) 25 מ&quot;ל PN חיץ (מתכון לעיל) מערבב לדקות 15-20 עם ערבוב מתמיד. ספין 2 פעמים ב 400 XG למשך 10 דקות. השתמש supernatant, ולוודא שלא להפריע חלבוני חלב זרזו. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

שכפול הדנ&quot;א יונקים יוזם באתרים מרובים לאורך הכרומוזומים בזמנים שונים במהלך שלב S, בעקבות תכנית שכפולה של זמן. המפרט של עיתוי שכפול הוא חשב להיות תהליך דינמי מוסדר על ידי רמזי רקמות ספציפיות והתפתחותית המגיבים לשינויי epigenetic. עם זאת, המנגנונים המסדירים היכן ומתי שכפול הדנ&quot;א יוזם יחד הכרומוזומים נשארו הבינו היטב. הומולוגי כרומוזומים בדרך כלל לשכפל סינכרוני, עם זאת יש יוצאים מן הכלל בולט לכלל זה. לדוגמה, בתאי יונקים ממין נקבה אחד משני כרומוזומי X הופך מאוחר משכפל באמצעות תהליך המכונה איון X 1. יחד עם זה עיכוב בעיתוי שכפול, מוערך 2-3 שעות, הרוב המכריע של גנים הופכים השתיק תעתיק על כרומוזום X אחד. בנוסף, מוקד דיסקרטי cis טווח, ידוע כמרכז איון X, מסדיר תהליך איון X זה, לרבות האינדוקצית דואר של עיתוי שכפול מתעכב על כרומוזום X הפעיל כולו. בנוסף, שחלופי כרומוזום מסוימים הנמצאים בתאים סרטניים ותאים שנחשפו לקרינה מייננת להציג עיכוב משמעותי בעיתוי שכפול של&gt; 3 שעות שמשפיעה על כל כרומוזום 2,3. העבודה אחרונה מהמעבדה שלנו מצביעה על שיבוש זה של דיסקרטי cis-מתנהג תוצאת לוקוסים אוטוזומלית בפנוטיפ משכפל מאוחר מאוד המשפיע על 4 כרומוזום השלמים. מחקרים &#39;הנדסי כרומוזום&#39; נוספת מצביעים על כך ששחלופי כרומוזום מסוימים המשפיעים על תוצאת כרומוזומים שונות רבה בפנוטיפ הנורמלי זה שכפול עיתוי, מצביעים על כך שכל הכרומוזומים היונקים מכילים לוקוסים בדידים cis-הפועלים ששולטים עיתוי שכפול תקין של כרומוזומים בודדים 5. כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח כמותי של עיתוי שכפול כרומוזום בשילוב עם ניאון כלאה באתר. זהשיטה מאפשרת השוואה ישירה של עיתוי שכפול בין כרומוזומים הומולוגיים באותו התא, והותאמה מ 6. בנוסף, שיטה זו מאפשרת זיהוי חד המשמעי של שחלופי כרומוזומליות הקשורים לשינויים בעיתוי שכפול המשפיעים על כל כרומוזום. לשיטה זו יש יתרונות על פני מערך מייקרו תפוקה גבוה פתח לאחרונה או רצף פרוטוקולים שלא מבחינים בין האללים הומולוגיים להציג מחדש ובבטלו מחדש-כרומוזומים. בנוסף, בגלל השיטה המתוארת כאן מעריכה תאים בודדים, זה יכול לזהות שינויים בעיתוי שכפול כרומוזום בשחלופים בכרומוזומים שנמצאים רק בחלק מהתאים באוכלוסייה.

דוגמה לניתוח תזמון השכפול לכרומוזום אנושי 6 מוצגת באיור 2. תאים המכילים מחיקה של ASAR6 הגן 4, הממוקם ב6q16.1, נחשפו לBrdU במשך 5 שעות, שנקטפו לתאי mitotic ומעובד לדגים עם בדיקת כרומוזום 6 צבע (Vysis) וכן שילוב BrdU. שים לב שיש הבדל משמעותי בדפוס פסי BrdU בין 6 של שניים, שעולה ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם ניאון<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים) כדי להעריך את עיתוי שכפול של כרומוזומים יונקים. טכניקה זו מאפשרת להשוואה הישירה של הכרומוזומים עצבו מחדש, ובטל מחדש-בתוך אותו התא.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

ב הכלאה באתרו עבור לוקליזציה המדויק של תמלילי בצמחים

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...