Name: chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00
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この作品は、米国国立がん研究所、CA131967からの助成金によってサポートされていました。

1。 BrdUの取り込み（末端標識） <ol><li> BrdUの添加する前に、150mmの組織培養ディッシュ24時間で約70％コンフルエンスに細胞をプレート。 </li><li>収穫前に適切な時点で20μg/ mlののBrdU（Sigma）を含有する新鮮な完全培地でメディアを交換してください。時間セルの長さは、BrdUによる培地で培養する細胞の種類や種によって異なりますが、一般的にG2期は2〜5時間（ 図1）が続きます?...

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

染色体スプレッドの調製は、ここで説明する正常な複製タイミングのアッセイのための重要なステップです。低張処理に先立っコルセミド前処理工程を含めることは、周波数と有糸分裂細胞の広がりを助けることができる。我々は通常、収穫前に1から3時間colcemdiに細胞を公開し、10μg/ mlの最終濃度でコルセミド使用します。しかし、コルセミド前処理工程を含めることは、G2の長さを変更す?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>抗BrdU-FITC </td><td>ロシュミリポア</td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50μg/μLの</td></tr><tr><td>ニックトランスレーションキット</td><td>アボット分子（Vysis） </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td>スペクトラムオレンジdUTPを</td><td>アボット分子（Vysis） </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td>アボット分子（Vysis） </td><td>変化する</td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCPハイブリダイゼーションバッファー</td><td>アボット分子（Vysis） </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEPのハイブリダイゼーションバッファー</td><td>アボット分子（Vysis） </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td>染色体パイNTS </td><td>メタシステムグループ</td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td>オリンパスBX61蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡イメージングソフトウェアシステム</td><td>アプライドイメージング</td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>オリンポス</td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> in situハイブリダイゼーションのレシピで ホルムアミドソリューション 70パーセントFormamide/2x SSC 35ミリリットルホルムアミド*（シグマ） 10ミリリットル10倍のSSC 5ミリリットルD 2 H 2 O HClでpH7.0に（シグマ） *これは、-20℃で保管されていることホルムアミドを使用することが重要です。長時間の室温貯蔵ではギ酸とpHワットを生成します病気低すぎるかも。 50パーセントFormamide/2x SSC 25mlのホルムアミド（シグマ） 10ミリリットル10倍のSSC 15ミリリットルのdH 2 O HClでpH7.0に（シグマ） 20×SSC、4 L 702グラムのNaCl（シグマ） 358グラムのNaクエン酸（シグマ） ボリュームへのdH 2 O PNバッファ[0.1MのNaP0 4 0.1％NP_40（シグマ）] 0.1M溶液リン酸ナトリウムのそれぞれを（フィルター滅菌し、500mlアリコートで保存）してください。 、0.1MのNaH 2 PO 4、1L 13.8グラムのNaH 2 PO 4（シグマ）： ボリュームへのdH 2 O 、0.1MのNaH 2 PO 4、1L </strオング&gt; 14.2グラムのNaH 2 PO 4（シグマ） ボリュームへのdH 2 O。 PN：0.1 MのNaH 2 PO 4と0.1Mの2 HP0 NA 4 pHは8.0のpHを調整する。殺菌フィルタリングおよびNP-40の1 mlを加える。 PNMは50ミリリットル 1.25グラム無脂肪ドライミルク（シグマ） 25ミリリットルのPN緩衝液（上記レシピ） 絶えず撹拌しながら15〜20分間混ぜる。 10分間、400×gで2回スピン。上清を使用し、析出した乳蛋白質を乱さないように注意してください。 </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

哺乳類のDNA複製は、時間的なレプリケーション·プログラムに続いて、S期に異なる時点で染色体に沿って、複数のサイトで開始されます。複製タイミングの仕様は、エピジェネティックな修飾に敏感な組織特異的、発達的な手がかりによって規制ダイナミックなプロセスであると考えられている。しかし、どこで、DNA複製が染色体に沿って開始したときに調節メカニズムはよくわかっていないままです。相同染色体は通常、同期複製は、しかし、この規則には注目すべき例外があります。例えば、女性の哺乳動物細胞内で2本のX染色体の一つがX不活性1として知られるプロセスを通じて後期複製になります。 2〜3時間であると推定複製タイミングでこの遅延に伴い、遺伝子の大部分は、転写一つのX染色体上に沈黙なる。また、X不活性化の中心地として知られ、離散シス作用性遺伝子座は、目を含めて、このX不活化工程を調節全体の不活性X染色体上の遅延複製タイミングの電子誘導。また、癌細胞では、細胞内に存在する特定の染色体再配列は、電離放射線にさらされる染色体全体に影響を及ぼす2,3&gt; 3時間の複製タイミングで大幅な遅延が表示されます。我々の研究室から最近の研究では、離散と混乱シス作用性染色体全体の4に影響を与える非常に遅く複製表現型常染色体の遺伝子座の結果を示します。追加された&#39;染色体工学&quot;の研究では、すべての哺乳類の染色体は、個々の染色体の適切な複製タイミング5を制御離散シス作用性遺伝子座が含まれていることを示唆し、この異常な複製タイミングの表現型には多くの異なる染色結果に影響を与え、特定の染色体再配列を示す。 ここでは、蛍光in situハイブリダイゼーションと組み合わせた染色体複製タイミングの定量分析のための方法を提示する。このメソッドは、同じセル内の相同染色体間で複製タイミングの直接比較を可能にし、6から適応されました。さらに、このメソッドは、染色体全体に影響を与える複製タイミングの変化と相関染色体再編成の明確な識別を可能にします。この方法では、最近開発されたハイスループットマイクロアレイまたは相同対立遺伝子が再編成と非再配列染色体上に存在を区別することはできませんシーケンスプロトコルの上で利点があります。ここで説明する方法は、単一細胞を評価するためだけでなく、それは、集団中の細胞の一部のみに存在する染色体再配列で染色体複製タイミングの変化を検出することができます。

ヒトの6番染色体の複製タイミング解析の例を図2に示します。 6q16.1に位置ASAR6遺伝子4の欠失を含む細胞は、5時間のBrdUにさらされる有糸分裂細胞のために収穫し、6番染色体ペイントプローブ（Vysis）で魚やBrdUの取り込みのために処理した。 2 6の、第6染色体の一つのために&gt; 2時間の複製タイミングの遅延と一致している間にBrdUのバンドパターンに有意差があることに注...

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Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

染色体の複製タイミングの解析のための定量的な方法が記載されている。この方法は、蛍光との組み合わせでBrdUの取り込みを利用<em&gt;その場で</em&gt;哺乳類の染色体の複製タイミングを評価するためのハイブリダイゼーション（FISH）。この技術は、同じセル内に再配置および再配置非染色体の直接比較することができます。

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

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Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

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