Name: chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00
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이 작품은 국립 암 연구소, CA131967의 교부금에 의해 지원되었다.

1. BrdU의 설립 (터미널 라벨링) <ol><li> 이전 BrdU의 추가로 150mm 조직 문화 요리 24 시간에 약 70 %의 합류로 플레이트 세포. </li><li> 전에 수확에 적합한 시간 지점에서 20 μg / ML BrdU (시그마)를 포함하는 신선한 완벽한 미디어와 미디어를 대체합니다. 시간이 세포의 길이는 BrdU는 일반적으로 G2 단계는 시간 (그림 1) 2 사이 5 정도, 세포 유형 및 종과 다를 수있는 미디어에 배양되어 있습니다...

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

염색체 확산의 준비는 여기에 설명 된 성공적인 복제 - 타이밍 분석을위한 중요한 단계입니다. hypotonic 치료 전에 colcemid 전처리 단계의 포함은 주파수와 mitotic 세포의 확산에 도움 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 수확하기 전에 1-3 시간에 colcemdi에 세포를 노출, 10 UG / ML의 최종 농도에 colcemid 사용합니다. 그러나, colcemid 전처리 단계의 포함은 G2의 길이를 변경할 수 있으며, 그 결과 염색체 3<...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 안티 BrdU-FITC </td><td> 로슈 Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 μg / μl </td></tr><tr><td> 닉 번역 키트 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> 스펙트럼 오렌지 dUTP </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 다름 </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP 하이브 리다이 제이션 버퍼 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP의 하이브 리다이 제이션 버퍼 </td><td> 애보트 분자 (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> 염색체 파이국세청 </td><td> MetaSystems 그룹 </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> 올림푸스 BX61 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> 현미경 이미징 소프트웨어 시스템 </td><td> 응용 이미징 </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> 디지털 카메라 </td><td> 하늘 </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 현장 하이브 리다이 제이션 요리 IN 포름 아미드 솔루션 70% Formamide/2x SSC 35 ML 포름 아미드 * (시그마) 10 ML 10X SSC 5 ML D 2 H 2 0 HCL와 7.0 산도 (시그마) *이 -20 ° C.에 저장되어 그 포름 아미드를 사용하는 것이 중요합니다 장시간 실온 보관이 개미의 산성과 pH의 w를 생성합니다병 너무 낮. 50% Formamide/2x SSC 25 ML의 포름 아미드 (시그마) 10 ML 10X SSC 15 ML DH 2 O HCL와 7.0 산도 (시그마) 20x SSC, 4 L 702g NaCl (시그마) 358g 오세영 구연산 (시그마) 볼륨 DH 2 O PN 버퍼 [0.1 M NaP0 4 0.1 % NP_40 (시그마)] 0.1 M 솔루션 인산 나트륨의 각 (필터 소독, 500 ML의 aliquots에 저장)을 확인합니다. 0.1 M 아뇨 2 P0 4, L 13.8 g 아냐이 P0 4 (시그마) : 볼륨 DH 2 O 0.1 M 아뇨 2 P0 4 1 패 </str긴 사연&gt; 14.2 g 아냐이 P0 4 (시그마) 볼륨 DH 2 O. PN : 0.1 M 아뇨 2 P0 4 2 HP0 4 산도 8.0 NA 0.1 M의 pH를 조정합니다. 필터 살균 및 NP-40의 1 ML를 추가합니다. PNM 50 ML 1.25 g 비 지방 건조 우유 (시그마) 25 ML PN 버퍼 (위 레시피) 지속적으로 저어로 15-20 분 동안 섞는다. 10 분 400 XG에 2 번 봐. 표면에 뜨는 사용하여 유발 우유 단백질을 방해하지 않도록하십시오. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

포유류의 DNA 복제는 일시적 복제 프로그램에 따라, S 단계 동안 다른 시간에 염색체를 따라 여러 사이트에서 시작합니다. 복제 타이밍 사양은 epigenetic 수정에 대한 반응 조직 별 및 발달 신호에 의해 규제 동적 과정이라고 생각합니다. 그러나, 어디에서 DNA 복제가 염색체 함께 시작하면 규제 메커니즘을 제대로 이해 남아 있습니다. 상동 염색체는 보통 그러나이 규칙에 중요한 예외가 있습니다, 동기식 복제합니다. 예를 들어, 여성 포유류의 세포에 두 개의 X 염색체 중 하나는 X의 불 활성화 1로 알려진 과정을 통해 늦은 복제됩니다. 2-3 시간이 될 것으로 추정 복제 타이밍,이 지연과 함께 유전자의 대부분은 transcriptionally 한 X 염색체에 침묵된다. 또한, X의 불 활성화 센터로 알려진 이산 시스 - 연기의 궤적은, 일 포함하여이 X의 불 활성화 과정을 조절전체 비활성 X 염색체에 지연 복제 타이밍의 전자 유도. 또한, 암 세포와 세포에서 발견 특정 염색체 rearrangements는 전체 염색체에게 2,3에 영향을 미치는&gt; 3시간 그 복제 타이밍에 상당한 지연을 표시 이온화 방사선에 노출. 우리 연구실의 최근 작품은 이산의 중단 시스 - 행동의 전체 염색체 (4)에 영향을 미치는 매우 늦은 복제 표현형에 염색체 loci 결과를 나타냅니다. 추가 &#39;염색체 공학&#39;연구는 포유류의 염색체는 각 염색체의 적절한 복제 타이밍 5 제어 이산 시스 - 행동 loci가 포함되어 있다는 제안이 이상 복제 - 타이밍 표현형의 다양한 염색체 결과에 영향을 미치는 특정 염색체 rearrangements를 나타냅니다. 여기, 우리는 현장 하이브리드 화에 형광과 결합 염색체 복제 타이밍의 정량 분석​​하는 방법을 제시한다. 이방법은 동일한 세포 내에서 상동 염색체 간의 복제 타이밍의 직접 비교를 허용, 6에서 적응되었습니다. 또한,이 방법은 전체 염색체에 영향을 복제 타이밍의 변화와 연관 염색체 rearrangements의 모호 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 최근에 개발 된 높은 처리량 마이크로 어레이 이상 또는 재 배열 및 염색체를 취소 뜯어을 제시 상동 대립 유전자를 구별 할 수 없습니다 프로토콜을 시퀀싱 장점이 있습니다. 여기에 설명 된 방법은 하나의 셀을 평가하기 때문에 또한, 그것은 인구의 셀의 일부만에 존재하는 염색체 rearrangements의 염색체 복제 타이밍의 변화를 감지 할 수 있습니다.

인간의 염색체 6의 복제 타이밍 분석의 예는 그림 2에 표시됩니다. 6q16.1에있는 ASAR6 유전자 4의 삭제를 포함하는 셀은 5 시간에 BrdU에 노출 mitotic 세포에 대한 수확 및 염색체 6 페인트 프로브 (Vysis)와 물고기와 BrdU의 설립에 대한 처리되었습니다. 두 6의 사이 BrdU 구간 패턴에 상당한 차이가 있습니다, 이는 이전에 염색체 6의 [표시 4 염색체 6 패턴을 구간 복제 타이밍에 ?...

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Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을 활용<em&gt; 현장에서</em&gt; 포유류의 염색체 복제 타이밍을 평가하는 하이브리드 (물고기). 이 기술은 동일한 세포 내에서 재 배열 및 취소 - 재 배열 염색체의 직접적인 비교를 할 수 있습니다.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

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