Name: chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Cancer Institute, CA131967.

1. BrdU Incorporation (Terminal Merking) <ol><li> Plate celler til omtrent 70% konfluens i en 150 mm vevskultur parabolen 24 hr før tilsetningen av BrdU. </li><li> Erstatt medier med fersk komplette medier inneholdende 20 pg / ml BrdU (Sigma) på hensiktsmessige tidspunkter før høsting. Lengden av tid dyrkes cellene i medier med BrdU vil variere med celletype og arter, vanligvis G2 fasen varer mellom 2 og 5 timer (figur 1). </li></ol> 2. Kromosom Harvest of Monolayer Cells kul...

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

Utarbeidelse av kromosom sprer er et kritisk punkt for vellykket replikering-timing analysen beskrevet her. Inkludering av en colcemid forbehandling trinn før hypoton behandling kan hjelpe til frekvens og spredning av mitotiske celler. Vi vanligvis eksponere cellene til colcemdi for 1-3 hr før høsting, og bruke colcemid ved en endelig konsentrasjon på 10 ug / ml. Imidlertid kan det inntas et colcemid forbehandling trinn endre varigheten G2 og dermed kan endre den tilsynelatende replikering timing og tilstand av kond...

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på Reagens </td><td> Selskapet </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (valgfritt) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 ug / ul </td></tr><tr><td> Nick Oversettelse Kit </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrum Orange dUTP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> Varierer </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP hybridiseringsbuffer </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP hybridiseringsbuffer </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Kromosom paints </td><td> MetaSystems Gruppe </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX61 Fluorescent Microscope </td><td> Olympus </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop bildebehandling software system </td><td> Applied Imaging </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Digital Camera </td><td> Olympus </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> In situ hybridisering OPPSKRIFTER Formamide Solutions 70% Formamide/2x SSC 35 ml formamid * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH til 7,0 med HCl (Sigma) * Det er viktig å bruke formamid som er blitt lagret ved -20 ° C. Langvarig romtemperatur lagring vil generere maursyre og pH will være for lavt. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamid (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH til 7,0 med HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na sitrat (Sigma) dH 2 O til volum PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Lage en 0,1 M oppløsning hver av natriumfosfat (Filter sterilisere og lagre i 500 ml aliquoter). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 l 13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O til volum 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L </strong&gt; 14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O til volum. PN: Juster pH av 0,1 M Na 2 HP0 4 til pH 8,0 med 0,1 M NaH 2 P0 4. Filter sterilisere og tilsett 1 ml NP-40. PNM 50 ml 1,25 g ikke-fett tørrmelk (Sigma) 25 ml PN buffer (Oppskrift ovenfor) Bland i 15-20 minutter med konstant omrøring. Spin 2 ganger ved 400 xg i 10 min. Bruk supernatant, og sørg for ikke å forstyrre utfelte melkeproteiner. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

Pattedyrs DNA replikasjon initierer på flere steder langs kromosomene til forskjellige tider i løpet av S-fasen, etter en temporal replikering program. Spesifisering av replikering timing er tenkt å være en dynamisk prosess regulert av vevsspesifikke og utviklingsmessige signaler som er mottakelig for epigenetic endringer. Men fortsatt mekanismene som regulerer hvor og når DNA replikasjon initierer langs kromosomene dårlig forstått. Homologe kromosomer vanligvis replikere synkront, men det er bemerkelsesverdig unntak til denne regelen. For eksempel, i kvinnelige pattedyrceller en av de to X-kromosomer blir sent replikerende gjennom en prosess kjent som X inaktivering 1. Sammen med denne forsinkelsen i replikering timing, anslått til å være 2-3 timer, blir de fleste av gener transkripsjonelt taushet på ett X-kromosom. I tillegg regulerer en diskret cis virkende locus, kjent som X-inaktivering sentrum denne X inaktivering prosessen, inkludert the induksjon av forsinket replikering timing på hele inaktive X-kromosom. I tillegg er visse kromosom rearrangementer funnet i kreftceller og i celler eksponert for ioniserende stråling vise en betydelig forsinkelse i replikasjon timing av&gt; 3 timer som påvirker hele kromosom 2,3. Nyere arbeid fra vårt laboratorium tyder på at forstyrrelser av diskrete cis-fungerende autosomal loci resulterer i en ekstremt sent replikere fenotype som påvirker hele kromosom 4. Ekstra &quot;kromosom tekniske &#39;studier tyder på at visse kromosom rearrangements påvirker mange forskjellige kromosomer resultat i denne unormale replikering-timing fenotype, noe som tyder på at alle pattedyr kromosomer inneholder diskrete cis-virkende loci som styrer riktig replikering timing av enkelte kromosomer 5. Her presenterer vi en fremgangsmåte for kvantitativ analyse av kromosomreplikasjon timing kombinert med fluorescerende in situ hybridisering. Dettefremgangsmåte tillater en direkte sammenligning av replikering timing mellom homologe kromosomer innenfor samme celle, og ble tilpasset fra 6. I tillegg gir denne metoden for entydig identifikasjon av kromosomale rearrangements som korrelerer med endringer i replikering timing som påvirker hele kromosom. Denne metoden har fordeler fremfor nylig utviklet høy gjennomstrømming microarray eller sekvensering protokoller som ikke kan skille mellom homologe alleler stede på omorganiseres og un-omorganisert kromosomer. I tillegg, fordi metoden beskrevet her evaluerer enkeltceller, kan det oppdage endringer i kromosomreplikasjon timing på kromosomale rearrangements som er tilstede i bare en brøkdel av de celler i en populasjon.

Et eksempel på replikering analyse timing for menneskets kromosom 6 er vist i figur 2. Celler som inneholder en sletting av ASAR6 genet 4, som ligger på 6q16.1, ble utsatt for BrdU for 5 timer, høstet for mitotiske celler og behandles for fisk med et kromosom 6 maling probe (Vysis) og for BrdU inkorporering. Merk at det er en betydelig forskjell i BrdU banding mønster mellom de to 6-ere, som er forenlig med en forsinkelse i replikasjon timing av&gt; 2 t for en av kromosom 6 står [se <sup...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

En kvantitativ fremgangsmåte for analyse av kromosomreplikasjon timingen er beskrevet. Metoden utnytter BrdU inkorporering i kombinasjon med fluorescerende<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) for å vurdere replikering timing av pattedyr kromosomer. Denne teknikken gjør det mulig for direkte sammenligning av omorganiseres og un-rearrangerte kromosomer innenfor den samme cellen.

Kromosom Replikere Timing Kombinert med fluoriserende<em&gt; I situ</em&gt; Hybridisering

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridisering for presis lokalisering av Avskrifter i Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Påvisning av virale RNA ved fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Fysisk Kartlegging av kromosomer som bruker Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse av encellede gentranskripsjon av RNA Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hele Mount RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoer

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...