Name: chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional do Câncer, CA131967.

1. BrdU Incorporação (Rotulagem Terminal) <ol><li> Células da placa para cerca de 70% de confluência, em cultura de tecido 150 milímetro hr prato 24 antes da adição de BrdU. </li><li> Substitua com meios frescos meio completo contendo 20 ng / ml de BrdU (Sigma) em pontos de tempo apropriados antes da colheita. A duração do tempo de células são cultivadas em meios com BrdU irá variar com o tipo de células e espécies, normalmente a fase G2 dura entre 2 e 5 horas (Figura 1). </li></ol><p cl...

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

A preparação dos spreads cromossoma é um passo crítico para o ensaio de replicação de temporização-sucedido descrito aqui. A inclusão de um passo de pré-tratamento antes da colcemida tratamento hipotónico pode auxiliar na frequência e propagação de células em mitose. Nós normalmente expor as células a colcemdi durante 1-3 horas antes da colheita, e usar colcemida, a uma concentração final de 10 ug / ml. No entanto, a inclusão de um passo de pré-tratamento colcemida podem alterar o comprimento de G2 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 ug / ul </td></tr><tr><td> Nick Tradução Kit </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Espectro laranja dUTP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> Varia </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP tampão de hibridação </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP tampão de hibridação </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Cromossomo paints </td><td> MetaSystems Grupo </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Olympus BX61 Fluorescente </td><td> Olimpo </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio sistema de software de imagem </td><td> Aplicada imagem </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera Digital </td><td> Olimpo </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Em receitas de hibridação in situ Soluções formamida 70% Formamide/2x SSC 35 ml formamida * (Sigma) 10 ml SSC 10x 5 ml d 2 H 2 0 pH a 7,0 com HCl (Sigma) * É importante a utilização de formamida que foi armazenado a -20 ° C. Temperatura de armazenamento prolongado sala vai gerar ácido fórmico e do pH wmal estar muito baixa. 50% Formamide/2x SSC 25 ml de formamida (Sigma) 10 ml SSC 10x 15 ml de dH2O pH a 7,0 com HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g de NaCl (Sigma) 358 g Citrato de sódio (Sigma) dH 2 O para o volume PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Fazer uma solução 0,1 M de cada de fosfato de sódio (Filtrar esterilizar e armazenar em alíquotas de 500 ml). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g de NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O para o volume 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L </strong&gt; 14,2 g de NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O para volume. PN: Ajustar o pH de 0,1 M de Na 2 HP0 4 a pH 8,0 com 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtrar esterilizar e adicionar 1 ml de NP-40. PNM 50 ml 1,25 g de leite seco não gordo (Sigma) 25 ml de tampão PN (receita acima) Mistura-se durante 15-20 minutos com agitação constante. 2 vezes girar a 400 xg durante 10 min. Use sobrenadante, e certifique-se de não perturbar as proteínas do leite precipitados. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

A replicação do ADN de mamíferos inicia em múltiplos locais ao longo de cromossomas, em momentos diferentes durante a fase S, na sequência de um programa de replicação temporal. A especificação do tempo de replicação é pensado para ser um processo dinâmico, regulado por sinais específicos de tecido e de desenvolvimento, que são sensíveis às modificações epigenéticas. No entanto, os mecanismos de regulação, onde e quando inicia a replicação de ADN ao longo de cromossomas permanece pouco compreendido. Cromossomos homólogos geralmente replicar de forma síncrona, no entanto, existem notáveis ​​exceções a esta regra. Por exemplo, em células de mamíferos do sexo feminino de um dos dois cromossomas X torna-se tarde replicação através de um processo conhecido como X inactivação 1. Juntamente com este atraso no tempo de replicação, estimada em 2-3 horas, a maioria dos genes silenciados transcricionalmente em tornar-se um cromossoma X. Além disso, um locus de cis-acting discreta, conhecida como o centro de inactivação X, regula este processo de inactivação X, incluindo thindução e do tempo de replicação atraso no cromossomo X inteiro inativo. Além disso, os rearranjos certas encontrados em células cancerosas e em células expostas à radiação ionizante exibir um atraso significativo no tempo de replicação de&gt; 3 horas que afeta o cromossoma inteiro 2,3. Um trabalho recente de nosso laboratório indicam que a ruptura do discreto cis-acting resultado loci autossômica em um fenótipo extremamente tarde replicante que afeta o cromossomo 4 inteiro. Estudos adicionais &quot;engenharia cromossomo &#39;indicam que os rearranjos cromossômicos determinados que afetam muitos cromossomos resultado diferente neste fenótipo replicação timing anormal, sugerindo que todos os cromossomos de mamíferos contêm discretos cis-agindo loci que controlam a replicação de tempo adequado de cromossomos individuais 5. Aqui, nós apresentamos um método para a análise quantitativa de temporização replicação cromossoma combinada com hibridação in situ fluorescente. Estemétodo permite uma comparação directa de temporização replicação entre cromossomas homólogos dentro da mesma célula, e foi adaptada a partir de 6. Além disso, este método permite a identificação inequívoca dos rearranjos cromossómicos que se correlacionam com alterações no tempo que afectam a replicação do cromossoma inteiro. Este método apresenta vantagens em relação recentemente desenvolvido elevado rendimento matriz de micro-sequenciação ou os protocolos que não pode distinguir entre homólogos alelos presentes no rearranjados e un-rearranjado cromossomas. Além disso, porque o método descrito aqui, avalia células individuais, que podem detectar alterações na temporização cromossoma replicação em rearranjos cromossómicos que estão presentes em apenas uma fracção das células de uma população.

Um exemplo da análise de tempo de replicação para cromossoma 6 humano é mostrada na Figura 2. As células que contêm uma deleção do gene ASAR6 4, localizada em 6q16.1, foram expostas a BrdU durante 5 horas, colhidas para células mitóticas e processados ​​por FISH com sonda de tinta cromossoma 6 (Vysis) e para a incorporação de BrdU. Note-se que há uma diferença significativa no padrão de BrdU bandas entre os dois 6, o que é consistente com um atraso no tempo de replicação...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Um método quantitativo para a análise da replicação do cromossoma de temporização é descrito. O método utiliza a incorporação de BrdU, em combinação com fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Hibridização (FISH) para avaliar a temporização da replicação dos cromossomas de mamíferos. Esta técnica permite a comparação direta dos cromossomos reorganizados e não-reorganizadas dentro da mesma célula.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Hibridização In Situ para a localização precisa de transcrições em Plantas

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...