Name: chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Cancer Institute, CA131967.

1. BrdU Införlivande (Terminal Märkning) <ol><li> Plate celler till cirka 70% konfluens i en 150 mm vävnadsodlingsskål 24 h före tillsatsen av BrdU. </li><li> Ersätt media med färskt komplett medium innehållande 20 pg / ml BrdU (Sigma) vid lämpliga tidpunkter före skörd. Den tid celler odlas i medium med BrdU varierar med celltyp och art, typiskt G2-fasen varar mellan 2 och 5 timmar (figur 1). </li></ol> 2. Kromosom Skörd av monolager Cells kulturer <ol><li> Avlä...

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

Beredningen av kromosom sprider är ett kritiskt steg för att framgångsrikt replikering-timing analys som beskrivits här. Införandet av en Colcemid förbehandlingssteg före hypoton behandling kan hjälpa frekvens och spridning av mitotiska celler. Vi utsätter typiskt celler till colcemdi för 1-3 timmar före skörd och användning Colcemid vid en slutlig koncentration av 10 ng / ml. Emellertid kan införande av ett kolcemid förbehandlingssteg ändra längden på G2 och följaktligen kan förändra den skenbara r...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namn på reagens </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer (tillval) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 ug / ul </td></tr><tr><td> Nicktranslation Kit </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrum Orange dUTP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> Varierar </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP hybridiseringsbuffert </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP hybridiseringsbuffert </td><td> Abbott Molecular (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Kromosom paiNTS </td><td> MetaSystems Group </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX61 fluorescensmikroskop </td><td> Olympus </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop bildprogram systemet </td><td> Tillämpad Imaging </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Digitalkamera </td><td> Olympus </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> In situ-hybridisering RECEPT Formamid lösningar 70% Formamide/2x SSC 35 ml formamid * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d. 2 H 2 0 pH till 7,0 med HCl (Sigma) * Det är viktigt att använda formamid som har förvarats vid -20 ° C. Långvarig rumstemperatur lagring kommer att generera myrsyra och pH wsjuka vara för låg. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamid (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH till 7,0 med HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na-citrat (Sigma) dH 2 O till volym PN buffert [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Gör en 0,1 M lösning av vardera natriumfosfat (Filtrera sterilisera och förvara i 500 ml alikvoter). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O till volym 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L </strong&gt; 14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O till volym. PN: Justera pH av 0,1 M Na 2 HP0 4 till pH 8,0 med 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtersterilisera och tillsätt 1 ml av NP-40. PNM 50 ml 1,25 g Fettfri torrmjölk (Sigma) 25 ml PN-buffert (recept ovan) Blanda i 15-20 min med konstant omröring. Centrifugera 2 gånger vid 400 xg under 10 minuter. Använd supernatanten och se till att inte störa utfällda mjölkproteiner. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

Däggdjurs-DNA-replikation initieras vid flera ställen längs kromosomer vid olika tidpunkter under S-fasen, efter en tidsmässig replikering program. Specifikationen av replikering timing tros vara en dynamisk process regleras av vävnads-specifika och utvecklande ledtrådar som är lyhörda för epigenetiska modifieringar. Dock fortfarande de mekanismer som reglerar var och när DNA-replikation initierar längs kromosomer dåligt kända. Homologa kromosomer replikeras oftast synkront, men det finns viktiga undantag från denna regel. Till exempel i kvinnliga däggdjursceller en av de två X-kromosomer blir sen replikera genom en process som kallas X inaktivering 1. Tillsammans med denna fördröjning i replikering timing, uppskattas till 2-3 timmar, blir majoriteten av gener transkriptionellt tystas på en X-kromosom. Dessutom reglerar en diskret cis-verkande lokuset, känd som X inaktivering centrum, denna inaktivering X, inbegripet the induktion av fördröjd replikering timing på hela inaktiva X-kromosomen. Dessutom har vissa kromosom omdisponeringar som finns i cancerceller och celler som exponeras för joniserande strålning visa en signifikant fördröjning i replikering tidpunkten för&gt; 3 timmar som påverkar hela kromosom 2,3. Senaste arbete från vår labb visar att avbrott i diskreta cis-agerande autosomalt loci resulterar i en extremt sent replikera fenotyp som påverkar hela kromosom 4. Ytterligare &quot;kromosom tekniska&quot; studier visar att vissa kromosom omflyttningar påverkar många olika kromosomer resulterar i denna onormala replikering-timing fenotyp, vilket tyder på att alla däggdjur kromosomer innehåller diskreta cis-verkande loci som styr korrekt replikering tidpunkten för enskilda kromosomer 5. Här presenterar vi en metod för kvantitativ analys av kromosom-replikering timing kombinerat med fluorescent in situ hybridisering. Dettametod möjliggör en direkt jämförelse av replikering timing mellan homologa kromosomer inom samma cell, och anpassades från 6. Dessutom tillåter denna metod för otvetydig identifiering av kromosomala rearrangemang som korrelerar med förändringar i replikering timing som påverkar hela kromosomen. Denna metod har fördelar jämfört med nyutvecklade hög genomströmning mikro-array eller sekvensering protokoll som inte kan skilja mellan homologa alleler som finns på omarrangerade och un-ordnas kromosomer. Dessutom, eftersom den här beskrivna metoden utvärderar enskilda celler, kan man upptäcka förändringar i kromosom-replikering timing på kromosomala rearrangemang som är närvarande i endast en bråkdel av cellerna i en population.

Ett exempel på replikering timing analys för human kromosom 6 visas i figur 2. Celler som innehåller en deletion av ASAR6 genen 4, som ligger vid 6q16.1, utsattes för BrdU under 5 timmar, skördas för mitotiska celler och bearbetas för fisk med en kromosom 6 färg sond (Vysis) och för BrdU inkorporering. Observera att det finns en signifikant skillnad i BrdU bandmönster mellan de två 6 s, vilket är förenligt med en fördröjning i replikation tidpunkten för&gt; 2 h för en av krom...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

En kvantitativ metod för analys av kromosom-replikering timing beskrivs. Metoden utnyttjar BrdU-inkorporering i kombination med fluorescerande<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH) för att bedöma replikering tidpunkten för däggdjur kromosomer. Denna teknik möjliggör direkt jämförelse av omarrangerade och un-ordnas kromosomer i samma cell.

Kromosom Replikera Timing kombination med fluorescerande<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafisk Hela Mount högupplöst Dubbel Fluorescerande In Situ Hybridisering

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Fluorescens På plats Hybridisering (FISH) Protokoll i mänskliga spermier

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Hela berget<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av E8.5 till E11.5 musembryon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridisering för exakt lokalisering av transkript hos växter

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Detektering av viralt RNA genom Fluorescens<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Hög kapacitet fysisk Kartläggning av kromosomer med hjälp av automatiserad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analys av encelliga gentranskription av RNA-lysrör<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Hel Mount RNA Lysrör<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...