Name: chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü, CA131967 bir hibe ile desteklenmiştir.

1. BrdU Ortaklığın (Terminal Etiketleme) <ol><li> Önceki BrdU ilavesi ile 150 mm doku kültürü çanağı 24 saat içinde yaklaşık% 70 birleştiği yere Plaka hücreleri. </li><li> Hasattan önce uygun zaman noktalarında 20 ug / ml BrdU (Sigma) içeren tam kültür ortamı, taze ortam ile değiştirin. Zaman hücrelerin BrdU uzunluğu tipik olarak G2 fazında saat (Şekil 1) 2 ile 5 arasında sürer, hücre tipi ve türler ile değişecektir ile ortam içinde kültürlenmiştir. </li></ol><p c...

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

Kromozom yayılır hazırlanması burada açıklanan başarılı çoğaltma-zamanlama testi için kritik bir adımdır. Hipotonik tedavi öncesinde colcemid ön adım dahil sıklığı ve mitotik hücrelerin yayılmasını yardımcı olabilir. Bu tipik olarak hasat öncesi 1-3 saat için colcemdi hücrelerin ortaya çıkarmak, ve 10 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda colcemid kullanımı. Ancak, ön arıtma adımı colcemid dahil G2 uzunluğu değiştirebilir ve dolayısıyla kromozom 3&#39;ün yoğun...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Anti-BrdU-FITC </td><td> Roche Millipore </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 mikrogram / ul </td></tr><tr><td> Nick Çeviri Takımı </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> Spectrum Orange dUTP </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> Değişir </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP hibridizasyon tamponu </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP hibridizasyon tamponu </td><td> Abbott Moleküler (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> Kromozom paiNTS </td><td> MetaSystems Grubu </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX61 Floresan Mikroskop </td><td> Olimpos </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop görüntüleme yazılımı sistemi </td><td> Uygulamalı Görüntüleme </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> Dijital Kamera </td><td> Olimpos </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> YERİNDE HİBRİTLEŞMEYLE TARİFLER IN Formamid Çözümleri 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamid * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 HCI ile pH 7.0 &#39;a (Sigma) * Bu, -20 ° C&#39;de depolanmış olan o formamid kullanılması önemlidir Uzun süreli depolama oda sıcaklığında formik asit ile pH w üretecektirhasta çok düşük. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamid (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O HCI ile pH 7.0 &#39;a (Sigma) 20x SSC, 4 L&#39; 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Sitrat (Sigma) hacmi dH 2 O PN Tamponu [0,1 M NaP0 4% 0,1 NP_40 (Sigma)] 0.1 M çözelti sodyum fosfat her (Filtre sterilize ve 500 ml alikotları saklamak) olun. 0.1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13.8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): hacmi dH 2 O 0.1 M NaH 2 P0 4 1 M </strong&gt; 14.2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) hacmi dH 2 O. PN:, 1 M NaH 2 P0 4 ile 2 HP0 4 pH 8.0 0.1 M Na pH ayarlama. Filtre sterilize ve NP-40 1 ml ekleyin. PNM 50 ml 1.25 gram yağsız kuru süt (Sigma) 25 ml PN tamponu (yukarıda tarifi) Sürekli karıştırarak, yaklaşık 15-20 dakika boyunca karıştırılır. 10 dakika için 400 x g&#39;da 2 kez Spin. Süpernatant kullanın ve çöktürülmüş süt proteinleri rahatsız değil emin olun. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

Memeli DNA replikasyonu zamansal bir çoğaltma programı sonrasında, S fazında farklı zamanlarda kromozomlar boyunca birçok bölgeden başlatır. Çoğaltma zamanlaması özellikleri epigenetik değişikliklere duyarlı doku-spesifik ve gelişimsel ipuçları tarafından düzenlenen dinamik bir süreç olduğu düşünülmektedir. Ancak, nerede ve DNA replikasyonu kromozomlar boyunca başlattığında düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Homolog kromozomlar genellikle ancak bu kuralın önemli istisnalar vardır, eşzamanlı çoğaltırlar. Örneğin, dişi memeli hücrelerinde iki X kromozomu X inaktivasyonu 1 olarak bilinen bir süreç yoluyla geç kopyalayan olur. 2-3 saat olarak tahmin çoğaltma zamanlaması, bu gecikme ile birlikte, genlerin çoğunluğu transkripsiyonel bir X kromozomu üzerinde susturdu olur. Buna ek olarak, X inaktivasyonu merkezi olarak bilinen bir ayrık cis-hareket eden odağı, th dahil olmak üzere, bu X inaktivasyonu işlem düzenlertüm inaktif X kromozomu üzerinde gecikmiş çoğaltma zamanlaması e indüksiyonu. Buna ek olarak, kanser hücreleri ve hücreler bulunan bazı kromozom tüm kromozom 2,3 etkilemektedir&gt; 3 saat bunun çoğaltma zamanlaması önemli bir gecikme görüntülemek iyonizan radyasyona maruz. Bizim laboratuvar son çalışmaları ayrık olduğunu bozulması cis-oyunculuk tüm kromozom 4 etkileyen bir çok geç kopyalayan fenotipe otozomal lokus sonucu gösterir. Ek &#39;kromozom mühendislik&#39; çalışmaları tüm memeli kromozomları bireyin kromozom Uygun çoğaltma zamanlaması 5 kontrol ayrık cis-etkili lokus içeren düşündüren, bu anormal çoğaltma zamanlaması fenotipe birçok farklı kromozom sonucu etkileyen bazı kromozom göstermektedir. Burada, floresan in situ hibridizasyon ile kombine kromozom çoğaltma zamanlaması kantitatif analizi için bir yöntem mevcut. Buyöntem, aynı hücre içinde Homolog kromozomlar arasındaki çoğaltma zamanlaması doğrudan bir karşılaştırma sağlar, ve 6 uyarlanmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem tam kromozom replikasyonu zamanlama etkileyen değişiklikler ile ilişkili kromozomal düzenlenmesinde çok kesin tanımlanması için olanak sağlar. Bu yöntem son yıllarda geliştirilen yüksek kapasiteli mikro-dizi üzerinde veya yeniden düzenlenmiş ve kromozomlar un düzenlenmeyecek üzerinde sunmaktan homolog allelleri arasındaki farkı ayırt edemez protokolleri sıralama avantajları vardır. Burada açıklanan yöntem tek hücreler değerlendirir Buna ek olarak, bu bir nüfus içinde hücrelerin sadece küçük bir bölümü içinde mevcut olan kromozom üzerinde çevrilme kromozom replikasyonu zamanlama değişiklikleri tespit eder.

Insan kromozom 6 için çoğaltma zamanlama analizinin bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. 6q16.1 bulunan ASAR6 gen 4, bir silme içeren hücreler, 5 saat boyunca BrdU maruz mitotik hücre için hasat edilmiş ve bir kromozom 6 boya probu (Vysis) ile FISH ve BrdU eklenmesi için işleme tabi tutulmuştur. İki 6&#39;ın arasındaki BrdU bantlama modeli önemli bir fark olduğunu unutmayın, hangi öncesinde kromozom 6&#39;nın [bkz 4 6. kromozomun desen bantlama çoğal...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi kullanır<em&gt; In situ</em&gt; Memeli kromozom çoğaltma zamanlamasını değerlendirmek için hibridizasyon (FISH). Bu teknik aynı hücre içinde yeniden ve un-yeniden düzenlenmiş kromozomun doğrudan karşılaştırma olanağını sağlamaktadır.

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Bitkilerde Transkriptler Hassas Yerelleştirme Situ Hibridizasyon

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...