Name: high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA at JoVE.com

1。 MEAの準備<ol><li>以前は18またはそのようなマルチチャンネルシステムとして、MEAメーカーのベンダーから直接購入し説明されているようにエレクトロポレーション実験で使用するためのMEAは、標準のフォトリソグラフィ技術を用いて製造することができる<a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">（http:/www.multichannelsystems.com/）</a>とAlpha MED科学株式会社<a href="http://www.med64.com/" ...

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	<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li><li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems.">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742 (2001).</li><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells.">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550 (2002).</li><li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells.">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li><li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3'+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells.">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li><li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells.">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li><li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo.">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li><li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA.">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311 (1987).</li><li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipofection:+a+highly+efficient,+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure.">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413 (1987).</li><li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ,+on+a+partly+conductive+slide.">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li><li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers.">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017 (2011).</li><li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs.">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes.">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187 (2004).</li><li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+(ethyleneimine)+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium?+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer.">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells.">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture.">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li><li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+(MEA)+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording.">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li><li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays.">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li><li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery.">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li><li>Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+high-throughput+electroporation+chips.">Efficient and high-throughput electroporation chips.</a> , (2011).</li><li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays.">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo.">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region.">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594 (2005).</li><li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+electroporation:+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications.">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li><li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li></ol>

このビデオの記事では、siRNAのスクランブル配列とHeLa細胞の部位特異的なトランスフェクションのためのMEAの使用例を示します。この技術の利点の一つは、主要な細胞株を含む種々の細胞株への適用である。私たちの研究室では以前にE18の日齢のラットおよびスクランブルsiRNA配列とGFPプラスミド18,19とNIH-3T3細胞から主海馬ニューロン培養の部位特異的なトランスフェクションのため...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>細胞培地： アドバンストMEM L-グルタミン、200mMの ペニシリン/ストレプトマイシン ウシ胎仔血清</td><td> GIBCO /インビトロジェン Himedia研究所/ VWR ロンザグループ株式会社 GIBCO /インビトロジェン</td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td>細胞培地組成： アドバンスMEM中で2％のFBS、2％L-グルタミンおよび2％Pennstrep </td></tr><tr><td>トリプシンEDTA </td><td>メディアテック株式会社</td><td> 25から053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td>メディアテック株式会社</td><td> 21から040-CV </td><td></td></tr><tr><td> sequをスクランブルタグ付けアレクサ488とローダミンリファレンスのsiRNA </td><td>キアゲン社</td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーション緩衝液</td><td>バイオラッドラボラトリーズ</td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td>波形発生器</td><td>実利的な</td><td> 2414A </td><td>希望するパルスを供給することができます任意波形/パルス·ジェネレータを使用することができます。 </td></tr></table>

high efficiency, site-specific transfection of adherent cells with sirna using microelectrode arrays (mea)

このようなsiRNAおよびshRNAなどの真核生物とRNAi剤のその後の開発におけるRNAi経路の発見は、機能ゲノミクスおよび治療 ​​のための特定の遺伝子の1-8を黙らせる強力な方法を実現しました。 RNAiに基づく研究に関与する主な課題は、標的細胞へのRNAiの薬剤の送達である。このようなバルクエレクトロポレーションおよび化学的トランスフェクション法のような従来の非ウイルス送達技術は、多くの場合、配達上必要な空間的制御を欠いており、9月12日貧弱トランスフェクション効率を与える。このようなカチオン性脂質、カチオン性ポリマーとナノ粒子のような化学的トランスフェクション法の最近の進歩は非常に強化されたトランスフェクション効率が13をもたらしました。しかしながら、これらの技術は、まだ非常に小型化されたハイスループット技術、単一細胞研究と細胞間相互作用の調査を受けることができます配信を正確に空間的制御を提供するために失敗する。 ntは&quot;遺伝子送達で&gt;最近の技術の進歩は。接着細胞のハイスループットトランスフェクションの14から23、マイクロエレクトロポレーションを使用しているかの過半数を有効にしたマイクロスケールエレクトロポレーション（最大単セルまで）配達を正確に時空間制御を提供しており、示されている24から26までの高効率19を達成する。さらに、エレクトロポレーションベースのアプローチは、化学ベースのトランスフェクションの方法で必要に応じて、siRNAやDNA複合体とのインキュベーションの長時間（通常4時間）を必要とし、裸の​​siRNAやDNAの直接エントリにつながらない細胞質への分子。結果遺伝子の発現としては、トランスフェクション27後6時間、早ければ達成することができます。私たちのラボは、以前に付着哺乳動物細胞培養17-19にサイト固有のトランスフェクションのための微小電極アレイの使用（MEA）を実証してきました。 MEAベースのアプローチでは、遺伝的ペイロードの配信は、ローカライズされたマイクロスケールelectroporatiを介して実現されるセルの上に。選択された電極への電気パルスの印加は、刺激電極の領域に存在する細胞のエレクトロポレーションにつながる局所的な電界を発生させる。微小電極を独立して制御するには、トランスフェクションオーバー空間的、時間的な制御を提供し、また、同一の培養実験のスループットを向上させ、文化·ツー·文化の変動を減少させる上で実行される複数のトランスフェクションベースの実験を可能にします。 ここでは、実験装置やエレクトロポレーションを用いて蛍光標識スクランブル配列のsiRNAを用いて接着したHeLa細胞の標的とトランスフェクションのためのプロトコルを記述します。同じプロトコルはまた、プラスミドベクターのトランスフェクションのために使用することができます。また、ここで説明されたプロトコルは、簡単にマイナーな修正と哺乳動物細胞株の多様性に拡張することができます。事前定義されたおよびカスタムの両方の電極パターンとMEAの商業的利用は、この手法アクセシブルトンを作る基本的な細胞培養用器材のoほとんどの研究室。

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High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

記事の詳細は微小電極アレイ（MEA）を使用して付着した哺乳動物細胞培養におけるsiRNAのスクランブル配列の部位特異的なトランスフェクションするためのプロトコル。

微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

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