Name: in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen
Uploaded: 2012-09-20T12:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen at JoVE.com

ברצוננו להודות לכל תלמידים רבים בעבר לתואר ראשון, לתואר שני ופוסט דוקטורט שתרמו הזמן והמאמץ שלהם ללימוד fibrogenesis קולגן במעבדה שלנו. מדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה ספקו ברציפות מימון למחקרי קולגן.

הערה: המים המשמשים בכל הפרוטוקולים שיש התנגדות&gt; 18 MΩ.cm. 1. סיבי הקולגן Native <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 6 μl מים, 20 μl של 200 מ&quot;מ Na 2 HPO 4 מותאמים לחומציות 7 עם HCl ו 10 μl של 400 מ&quot;מ KCl בצינור microfuge ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) לצינור microfuge והמערבב. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בגוש חום שכבר מראש חמם עד 37 ° C ולהשאיר במשך 3 עד 4 שעות. בשלב זה, הפתרון צריך להיות מעט עכור ומכיל סיבי הקולגן בעיקר ילידים. </li></ol> 2. לונג קולגן ריווח סיבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיאליזת 1 מ&quot;ל של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) באמצעות קרום 12-14 kDa MWCO נגד 400 מ&quot;ל של מים ומחליף את המים ארבע פעמים על פני תקופה של 24 שעות בטמפרטורת חדר. Collag הדיאליזהמונומר en שאינו משמש מייד ניתן לאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 20 μl מים, 20 μl של 3 מ&quot;ג / מיליליטר גליקופרוטאין α1 חומצה במים ו20 μl של מונומר קולגן דיאליזה בצינור microfuge. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. בשלב זה, הפתרון צריך להיות מעונן ומכיל סיבי הקולגן בעיקר Fls. </li></ol> 3. לונג קולגן ריווח מגזרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 67 μl מים, 60 μl של חיץ 100 מ&quot;מימ גליצין-HCl ב-pH 3.3 ו 40 μl של 10 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP במים בצינור microfuge ומערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 33 μl של קולגן מונומר (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) לצינור microfuge והמערבב. הפתרון צריך להיות ברור וחסר צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את צינור microfuge המכיל תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. בשלב זה, הפתרון עדיין יופיע ברור, אבל צריךמכיל קולגן בעיקר SLS. </li></ol> 4. AFM אפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב פני השטח של פיסה יציץ מצורפת מצע AFM על ידי כיסוי המשטח יציץ עם חתיכת הסרט דביק ולאחר מכן הפריד אותו. בדקו את הקלטת לאחר מכן כדי לוודא שכל שכבה של יציץ נבקעה על מנת לצמצם חריגות על פני השטח ולהבטיח שהמדגם הישן יוסר אם תציץ הוא להיות בשימוש חוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 20 μl של פתרון קולגן ליפון למצע יציץ טרי בקע. השאר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשטוף את הפתרון של קולגן יפון עם מים. מומלץ שלא להחיל את המים ישירות על מרכז המצע יציץ אבל בקצה ולאפשר לו לזרום על פני המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את המשטח שמתחת זרם עדין של גז חנקן. כדאי להפנות את הזרם בקצה ולא במרכז המצע יציץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלת × 200,דגימות קולגן הילידים וFLS צריכות להראות גושים של סיבים. קולגן SLS לא יהיה גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המאפיינים הייחודיים של השלושה המבנים השונים קולגן ניתנים לצפייה על ידי AFM. באופן כללי, אנו סיבי קולגן עם תמונה מקוריים AFM במצב מגע לסירוגין באמצעות בדיקות סיליקון AFM, ואילו FLS וקולגן SLS סיבים אנחנו בדרך כלל תמונה עם AFM במצב קשר באמצעות בדיקות AFM סיליקון ניטריד. אנו עושים זאת בגלל הזמן ושיקולי עלות. בדיקות AFM סיליקון הן בדרך כלל חד יותר בדיקות סיליקון ניטריד AFM, שהופכים אותם שימושיים במיוחד עבור הדמית מבנה הפסים הצר יותר של סיבי הקולגן ילידים. עם זאת, בדיקות AFM סיליקון הן הרבה יותר פגיעות לזיהום על ידי דגימות קולגן מבדיקות AFM סיליקון ניטריד וצריכים להחליף בתדירות גבוהה. לכן, אנו שומרים את השימוש בסיליקון בדיקות AFM בעיקר לסיבי הקולגן ילידי הדמיה שבו רזולוציה היא הכרח גדול יותר ואנו פועלים במצב מגע לסירוגין לprolאונג חייהם של שימושיות. </li></ol> אנו ממליצים ראשונית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר שאמור להראות לפחות כמה מבני הקולגן. משם, בזום כדי לסרוק גדלים של 10 × 10 מיקרומטר 2 ואז 2 × 2 מיקרומטר 2 להתבונן מחזוריות banding של קולגן הטבעי וFLS, או את התכונות העדינות של קולגן SLS. זה גם רעיון טוב לבדוק לפחות בשני אזורים אחרים במדגם קולגן כדי לוודא שהסריקות הראשוניות הן מייצגות.

<ol>
	<li>Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+at+a+glance.">Collagen at a glance.</a> J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).</li><li>Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+Collagen+Characterization+for+Bio+Studies.">Guide to Collagen Characterization for Bio Studies.</a> J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).</li><li>Baselt, D. R., Revel, J. -. P., Baldeschwieler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfibrillar+Structure+of+Type+I+Collagen+Observed+by+Atomic+Force+Microscopy.">Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy.</a> Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).</li><li>Petruska, J. A., Hodge, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Subunit+Model+for+Tropocollagen+Macromolecule.">A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).</li><li>Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pattern+in+Native+Collagen.">Molecular Pattern in Native Collagen.</a> Nature. 219, 157-158 (1968).</li><li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extract+of+collagen+from+connective+tissue+by+neutral+salt+solutions.">Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions.</a> PNAS. 41, 1-7 (1955).</li><li>Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+assembly+of+collagen+revealed+by+atomic+force+microscopy.">Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).</li><li>Wood, G. C., Keech, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+of+fibrils+from+collagen+solutions.">The formation of fibrils from collagen solutions.</a> Biochem. J. 75, 588-597 (1960).</li><li>Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+Fibril+formation.">Collagen Fibril formation.</a> J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).</li><li>Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+collagen+fibrils+in+vitro;+the+assembly+process+depends+on+the+initiating+procedure.">Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure.</a> Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).</li><li>Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrous+long+spacing+collagen+ultrastructure+elucidated+by+atomic+force+microscopy.">Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).</li><li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+mucoprotein+with+soluble+collagen;+an+electron+microscope+study.">The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study.</a> PNAS. 37, 286-291 (1951).</li><li>Ghadially, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , (1988).</li><li>Paige, M. F., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+and+assembly+of+segmental+long+spacing+collagen+studied+by+atomic+force+microscopy.">Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy.</a> Micron. 74, 355-361 (2001).</li><li>Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+particle+type+in+certain+connective+tissue+extracts.">A new particle type in certain connective tissue extracts.</a> PNAS. 39, 459-470 (1953).</li><li>Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procollagen+segment-long-spacing+crystallites:+their+role+in+collagen+fibrillogenesis.">Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis.</a> PNAS. 76, 313-317 (1979).</li><li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+observations+of+certain+fibrous+structures+obtained+from+connective+tissue+extracts.">Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts.</a> JACS. 72, 3321-3322 (1950).</li><li>Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O+prokollagene+kohzi.">O prokollagene kohzi.</a> Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).</li><li>Lin, A. C., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+ultrastructure+of+fibrous+long+spacing+collagen+by+parallel+atomic+force+and+transmission+electron+microscopy.">Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy.</a> Proteins. 49, 378-384 (2002).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

המטוהרים מונומר קולגן הוא יציב ב-pH וטמפרטורה הנמוכים וההיווצרות של סיבי הקולגן ילידים למעשה כרוכה העלאת pH והטמפרטורה של פתרון מונומר קולגן. הליכים לכינון מחדש של סיבי הקולגן מפוספסים ממונומרים קיימים כבר יותר מ 50 שנים. ההליך שהמעבדה שלנו משמשת במחקרים הראשונים שלנו עם קולגן לפני 15 שנה 7 התבססה על נהלים סכם צ&#39;פמן ועמיתים לעבודה בשנת 1986 10. התנאים להיווצרות קולגן ליפון שבעבודה הקודמת היו 0.18 מ&quot;ג / מיליליטר מונומר קולגן בNa 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (אני = 0.2, pH 7.4) חיץ ב34 ° C. החסרון של זה ונהלים אחרים שניסינו הוא שיש תמיד סיבי unbanded נוצרו לצד הסיבים המפוספסים הרצויים. התנאים החדשים שלנו הם ~ 0.3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן בפוספט 100 מ&quot;מימ וKCl 100 מ&quot;מימ בשעת 7 pH השאיר על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות 3-4. Proceדורה מתוארת כאן שונה בכל היבט מההליך קודם להכנת סיבי הקולגן ילידים. אבל רוב ניכר, הכפלנו את הכח היוני על ידי העלאת ריכוז החיץ והוסיף KCl mM 100. העלייה בתוצאות חוזק יוניות במבנה אחיד יותר של סיבי הקולגן חברו באופן בלעדי. מניסיוננו, הפעמים היחידות שהליך זה לא מיוצר קולגן סוג היליד הייתה כאשר פתרון מונומר קולגן היה עובר את התאריך המומלץ של יצרן שימוש. כאשר זה קורה, מה שנצפה נע בין סיבים פחות שכולם unbanded לסיבים רבים עדיין נצפו אך ברובה unbanded. שימו לב שמונומר קולגן שפג תוקף יכול לעתים עדיין ניתן להשתמש בהצלחה כדי להפוך את הקולגן טבעי, אבל כאשר הוא נכשל, מונומר קולגן החדש בהחלט צריך לרכוש. FLS זוהה לראשונה על ידי Highberger et al. 17 בהכנות קולגן יזוכה Orekhovich et al. 18. מחקרים נוספים הובילו Highberger ושמיט למסקנה שזה היה גליקופרוטאין α1 חומצה שמקדם את ההיווצרות של 12 FLS. היינו מאוחר מסוגל לשכפל את ההליך להכנת קולגן FLS על ידי שילוב של מונומר קולגן הזמין מסחרי וגליקופרוטאין α1 חומצה ב-pH הנמוך ולאט הרשה pH לעלות ב dialyzing התערובת נגד מים ל24 11 שעות. כעת אנו מציגים שינוי של הליך זה על ידי dialyzing מונומר קולגן נגד מים הראשונים ופשוט משלב את זה עם גליקופרוטאין α1 חומצה במים ליצירה קולגן FLS. התנאים לFLS קולגן הרכבה המתואר כאן הם הרבה פחות זמן רב. מונומר קולגן עדיין צריך להיות טרום דיאליזה נגד מים, אבל אפשר לעשות את זה בכמויות גדולות ואז מאוחסן ב 4 ° C ביציבות עד שימוש בו. תשואות זה נוהל חדשה ברובה Fls סיבי הקולגן מפוספסים. מניסיוננו, α1 החומצה Glycoחלבון עם תכולת חלבון ומים משולבות נמוכה יותר, ועל ידי תכולת סוכר גבוהה היקש, הוא קריטי ליצירת סיבי Fls בהצלחה. אנחנו בדרך כלל לבדוק עם היצרן שהרבה גליקופרוטאין α1 החומצה אנו משתמשים יש% תכולת חלבון ומים משולבות של 82 או פחות. וכמו בנוהל לסינתזת הקולגן טבעית, מונומר קולגן שהיא מבוגר מדי יכול גם לגרום לכישלון לייצר קולגן FLS. בנוסף, את הטוהר של המים המשמשים לדיאליזה הוא קריטי בהליך זה. לדוגמה, דיאליזה של מונומר קולגן נגד אף ~ 8 MΩ.cm במקום&gt; תוצאות מים 18 MΩ.cm בפתרון קולגן שלא יוצר קולגן FLS. מהשלושה סוגי יפון קולגן, הקל ביותר לעשות הוא קולגן SLS. ההכנה המוקדמת SLS תוארה על ידי שמיט ועמיתים לעבודה 15. אנחנו פרסמנו adaption של הליך זה לפני 12 שנים להכנת קולגן SLS באמצעות coll הזמין מסחריAgen 14. ההליך פשוט כרוך בשילוב 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP ו 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן ב0.05% (v / v) חומצה אצטית ב-pH 3.5, ומשאיר את התערובת בטמפרטורת חדר למשך הלילה. מניסיוננו, ההיבט הקריטי של הרכבת SLS שחייב להיות מבוקרים הוא pH של תמיסת התגובה. SLS התאסף בתנאים יותר בסיסיים (pH ~ 3.6-3.9) תוצאות בגושים מצטברים של crystallites. תנאים יותר חומציים (pH ~ 2.9-3.2) תוצאות בcrystallites הרזה, יותר מאשר אלה מופרדים התאספו בתנאים האידיאליים של pH 3.3-3.5. PHS תגובה מחוץ לטווח זה (&lt;2.8 ו&gt; 4) לא מניב כל קולגן SLS. בעבר, כוונן את ה-pH של תערובת התגובה על ידי התוספת של חומצה אצטית. כדי לפשט את ההליך עוד יותר, בכתב היד הזה שהצגנו חיץ גליצין-HCl לשלוט חומציות. השלושה המבנים השונים נוצרו קולגן מהפרוטוקולים שתוארו לעיל יש אופיתכונות שהתאימו ניתן להבחין רק באמצעות מכשירים לרזולוציה של ננומטר. קולגן יליד וFLS מתאפיין banding periodicities של ~ 67 ננומטר ו ~ 270 ננומטר. הממד הארוך ביותר של קולגן SLS הוא רק ~ 360 ננומטר. יש לנו מתואר במפורש כיצד אנו משתמשים AFM לאפיין שלושה מבני הקולגן השונים. עם זאת, כל הפעלת AFM במגע או במצב קשר רציף עם כל AFM חללית ש&lt; רדיוס 10 ננומטר צריכה גם להיות מסוגלת לתמונת מבני הקולגן אלה. בנוסף, מיקרוסקופי אלקטרונים יכול להיות ונעשה שימוש כדי לאפיין מבני הקולגן אלה 19. היתרון העיקרי של הליכים אלה הוא שהם מייצרים בעיקר קולגן הרצוי לבנות. הצורה האחרת של קולגן רק כי הוא נמצא בתגובות האלה היא מונומר מתחיל, אשר לעתים קרובות נראה ברקע של תמונות AFM. במקרה של קולגן הטבעי וFLS, ניתן להפריד בקלות מרוב unreaמונומר cted ידי צנטריפוגה ושטיפה חוזרות והנשנים של ילידים וכתוצאה או FLS קולגן גלולה עם מים. יש לנו הצגנו נהלים פשוטים ואמינים להכנה, FLS ילידים וקולגן SLS תוך שימוש בחומרים מתקדמים, זמינים מסחרי החל. מונומר הקולגן משמש בכל הליכים אלה זמין מסחריים בצורה מטוהרת. גליקופרוטאין α1 חומצה ו-ATP גם שניהם זמינים באופן מסחרי.

קולגן הוא קבוצה של חלבונים מבניים שמבנה סליל משולש שנוצר משלוש רשתות פוליפפטיד. מונומרים סליל משולשים אלה נוספות להרכיב באופן היררכי בצורת מבנים הולכים וגדל. יש לפחות 28 סוגי קולגן שונים גנטי שזוהו 1. שילוב, collagens לפצות 30% מהחלבון הכולל למצוא חיות, עם סוג I חשבונאי צורה הבולטת לעד 90% מכלל חלבוני קולגן 2. קולגן אני מקליד נמצא כמבני fibrillous בעור, רצועות, גידים ועצמות. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM) תמונות של סוג I סיבי קולגן ילידים בדרך כלל מראה banding עם תקופה אופיינית ~ 67 ננומטר (המכונה לעתים קרובות D-banding) 3-5. הקלד אני מונומר קולגן הוא heterotrimer משולש סליל מורכב מα1 2 זהים (I) שרשרות ו1 α2 (אני) שרשרת, כל אחד יותר מאלף חומצות אמינו ארוך. הוא ארוך ודק עם ממדים של 300 ננומטר באורך 1.4 ננומטרים בקוטר. הקלד אני מונומר קולגן ניתן להשיג בקלות על ידי פירוק מבנים גבוהים יותר סדר שנוצרו באופן טבעי 6. אנחנו 7 ורבים 8-10 אחרים הראינו כי אובניים בניין מונומר המסיס אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לשחזר סיבי D-מפוספסים במבחנה (איור 1). בנוסף לסיבי הקולגן ילידים, שני מבני הקולגן אחרים גבוהים יותר סדר נמצאו כדי ליצור במבחנה באמצעות אותה אבן בניין מונומר. שני המבנים הם מרווח סיבי ארוך (FLS) וריווח ארוך מגזרי (SLS) קולגן (איור 1). FLS קולגן הוא מבנה fibrillous כמו קולגן הטבעי, אך מאופיין במחזוריות banding גדולה יותר קולגן יליד 11. במבחנה, קולגן FLS נוצר, כאשר מונומר קולגן הוא בשילוב עם חומצת גליקופרוטאין α1 <suעמ &#39;&gt; 12. קולגן FLS נצפה בחי, כמו גם, אם כי לעתים רחוקות 13. קולגן SLS מתואר כcrystallites כי מונומרים מיושרים בקופה כמו בסריג הגבישי 14. קולגן SLS נוצר, כאשר מונומר הקולגן משולב עם אדנוזין טריפוספט (ATP) 15. קולגן SLS טבעי נצפה במדיום התרבות של fibroblasts אך לא בדגימות רקמה שחולצה, ככל הנראה בשל הגודל והמחסור בתכונות הנבדלות טופוגרפיות 16 קטנים. המטרה של כתב יד זה היא להציג נהלים מפורטים להכנת סיבי הקולגן יליד כFLS גם וקולגן SLS שגם החוקר המנוסה ביותר יכול להתרבות. שימוש בחומרים מתקדמים החל מסחרי זמינים, יש לנו ניסינו לעשות את הפרוטוקולים פשוט ככל האפשר, ועדיין יש להם לעבוד באופן מהימן. אנחנו גם פירוט כיצד להשתמש AFM כדי לאפיין את מבנה קולגן השונהזה שהם עשו. עבודה זו תהיה מועילה לחוקרים שרוצים ללמוד אחד או יותר ממבנים מסדר הגבוהים יותר קולגן אלה ו / או להשתמש בם כמבשרים ביישומים אחרים, אבל כרגע חוסר של המומחיות או פשוט לא רוצה לעבוד עם דגימות רקמה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> חומר / מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> הקלד אני מונומר קולגן (~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ב0.01 N HCl) </td><td> Inamed המתקדם Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> הרבה 1261443 (2.9 מ&quot;ג / מ&quot;ל, pH 2.1) הרבה 1629346 (3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 2.1 pH) הרבה 6006 (3.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 2.1 pH) </td></tr><tr><td> ה-ATP </td><td> Biochemicals המחקר הבינלאומי </td><td> -141 </td><td> הרבה FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1 החומצה גליקופרוטאין מפלזמת שור </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G3643 </td><td> הרבה 051K7440 (89.8%) הרבה 011K7410 (82%) הרבה 065K7405 (71.2%) הרבה 063K7495 (71.9%) הרבה 117K7535 (75.9%) (+ תכולת מי חלבון) </td></tr><tr><td> glycopr A1 חומצהotein מפלזמה האנושית </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> G9885 </td><td> הרבה 128H7606 (70.9%) הרבה 049K7565V (68%) (+ תכולת מי חלבון) </td></tr><tr><td> תציץ </td><td> טד פלה </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - הסיליקון SPM-חיישן </td><td> Nanoworld </td><td> NHC </td><td> הסיליקון AFM בדיקה שאנו משתמשים למצב מגע לסירוגין </td></tr><tr><td> טיפי Nanoprobe Veeco </td><td> Veeco (עכשיו בדיקות Bruker AFM) </td><td> NP-S </td><td> חללית AFM סיליקון ניטריד שאנו משתמשים למצב קשר </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

סיבי הקולגן קיימים במטריקס מרקמות בעלי חיים כדי לספק פיגומים מבניים וחוזק מכאני. סיבי הקולגן ילידים אלה יש מחזוריות פסים אופיינית ל~ 67 ננומטר ונוצרים בגוף חי באמצעות ההרכבה ההיררכית של I מונומרים קולגן סוג, שהם 300 ננומטר באורך 1.4 ננומטרים בקוטר. במבחנה, על ידי שינוי התנאי של אובניים בניין מונומר חשוף, מבנים ייחודיים הנעים בסולמות באורך של עד 50 מיקרון ניתן לבנות, הכוללים לא רק סיבים מסוג מקומיים, אבל מרווח זמן גם סיבי קולגן וריווח הארוך המגזרי. בזאת, אנו מציגים הליכים להקמת השלושה מבני הקולגן השונים ממונומר קולגן הזמין מסחרי נפוץ. שימוש בפרוטוקולים שאנחנו ואחרים שפורסמו בעבר כדי להפוך את שלושת הסוגים האלה בדרך כלל להוביל לתערובות של מבנים. בפרט, סיבי unbanded היו נפוץ found עת ביצוע קולגן הטבעי, וסיבי ילידים נכחו לעתים קרובות בעת ביצוע קולגן מרווח הארוך סיבי. הנהלים החדשים אלה יש את היתרון של ייצור קולגן הסוג הרצוי יפון כמעט באופן בלעדי. ההיווצרות של המבנים המבוקשים מאומתת על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

קולגן Native תגובת התערובת של מונומר ~ 0.3 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן בפוספט 100 מ&quot;מימ וKCl 100 מ&quot;מימ ב-pH 7 השאיר על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות 3-4 יניב פתרון המכיל סיבי הקולגן סוג ילידים עם ננומטר banding D-ברורים ~ 67, ללא סיבי unbanded. תחת מיקרוסקופ אופטי בהגדלת × 200, גושים של כמה סיבים ניתן בדרך כלל לראות במצע יציץ במיוחד כאשר נצפים על ידי ניגוד פער התערבות (DIC) מיקרוסקופי (איור 2). במדגם טיפוסי, 100 × 2 סריקה אקראית 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות לפחות כמה סיבים שמיקרון ארוך 5-50 (איורי 3 א, ג). פרט, סיבי הקולגן מופרדים ניתן לזהות בקלות בשלב זה. עם 512 × 512 פיקסלים סריקת תמונה 2, התקרבות אל גודל 10 × 10 מיקרומטר סריקה 2 מראה שכל סיבי לימוד המאוחד (תרשימי 3d-f </strong&gt;). כדי למדוד במדויק מחזוריות banding, עדיף לזום של 2 × 2 2 גודל סריקת מיקרומטר (תרשימי 3G-i). Banding מחזוריות ניתן לקבוע על ידי מדידה פשוט וממוצע המרחק האורכי בין כמה פסגות או עמקים. לחלופין, אם התוכנה מאפשרת AFM, אחד פורה ממדי להפוך יחד חתך אורכים יכולים לשמש גם. איור 4 מראה תמונת גובה AFM של יפון וחתך אורכים מקביל. FLS קולגן תגובת התערובת של מ&quot;ג / מיליליטר גליקופרוטאין 1 μ1 חומצה ו~ מונומר 1 מ&quot;ג / מיליליטר קולגן במים שנשארו בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות תניב פתרון של סיבי הקולגן Fls. גושים של סיבים, בדומה למה שרואה במקרה של קולגן הטבעי, ניתן לראות בקלות על פני המצע יציץ תחת מיקרוסקופ אופטי ב 200 מ &#39;×agnification. במדגם טיפוסי, אקראית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות לפחות כמה סיבים. בגודל 512 × 512 סריקת פיקסל 2 תמונה, מחזוריות banding ניתן למדוד על ידי התקרבות ל10 × 10 מיקרומטר 2 סריקה (הציור 5a) או לייתר דיוק עם 2 × 2 מיקרומטר 2 סריקה (5 איור). האיור 5c תערוכות אורך חתך של FLS יפון. SLS קולגן תערובת התגובה של 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל ATP ו ~ 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של מונומר קולגן במאגר 100 מ&quot;מימ גליצין-HCl ב-pH 3.3 השאיר בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות יניב פתרון של קולגן SLS. בדרך כלל, crystallites SLS לא יהיה גלוי תחת מיקרוסקופ אופטי. AFM נדרש לאשר את קיומו של crystallites SLS. במדגם טיפוסי, אקראית 100 × 2 סריקה 100 מיקרומטר ידי AFM ניתן בדרך כלל לראות רביםנקודות. ההתקרבות אל 10 × 2 סריקת מיקרומטר 10 יהיה בדרך כלל להראות כמה crystallites SLS (איור 6 א). ו2 × 2 מיקרומטר 2 סריקה (איור 6 ב) מציגה את המבנה העדין של גביש SLS. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> איור 1. השלוש הצורות מבניות השונות של סיבי הקולגן שיכול להיוצר במבחנה ממונומר קולגן. AFM תמונות המתארות מונומר קולגן ושלושה מבני קולגן מהסדר הגבוהים יותר כולם באותו הגודל בקנה המידה (2 × 2 מיקרומטר 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> איור 2. תמונה דיגיטלית ב ~ גדלת 200 × ידי מיקרוסקופיה אופטית דסק סיבי הקולגן ילידים ביציצו (א) לא נגע ו( ב) thresholded וחדד to להדגיש את הסיבים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> איור 3. AFM תמונות של סיבי הקולגן טבעיים ביציצו. תמונות לסירוגין מגע מצב AFM משרעת מוצגות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> איור 4. () 0.5 × 1 תמונה 2 מיקרומטר לסירוגין מגע מצב AFM גובה (בקנה מידה אנכי = 100 ננומטר) וכן (ב)-חתך אורך של קולגן ליפון ילידים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> איור 5. AFM תמונות של סיבי הקולגן בFls יציץ. (א) 10 × 10 2 תמונת מצב מיקרומטר קשר AFM סטייה, (ב) 2 × 2 מיקרומטר 2 תמונת סטיית AFM מצב קשר ו( ג) אורכיםחתך של FLS קולגן ליפון. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> איור 6. AFM תמונות של קולגן SLS ביציץ. תמונות לסירוגין מגע מצב AFM משרעת מוצגות.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen at JoVE.com

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

נהלים פשוטים ולשעתק מתוארים לביצוע 3 אסיפות קולגן מבני מובחנות מסוג זמין מסחרי נפוץ אני מונומר קולגן. סוג ילידים, מרווח זמן סיבי קולגן או ריווח הארוך המגזרי ניתן לבנות על ידי שינוי התנאי שאת 300 ננומטר ארוך ובלוק 1.4 ננומטר קוטר מונומר בניין חשוף.

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Tri-שכבתית Electrospinning לחקות ארכיטקטורה העורקים באמצעות שפת Polycaprolactone, אלסטין, קולגן ו: מחקר ראשוני

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

פרוטוקול לאיתור גז הדחה בשלב רדיקלים חופשיים עשן סיגריות רגילה

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

ניצול של זיזי סיליקון המיקרוסקופים כדי להעריך את התפקוד נייד התכווצות<em&gt; במבחנה</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

ייצור של מעבר צבע Nanopattern על ידי טכניקת Nanoimprinting תרמית והקרנת התגובה של תאים אנושיים המושבה יוצרי אנדותל

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

Targeting the Rat's Small Bowel: Long-Term Infusion into the Superior Mesenteric Artery

מיקוד המעי הדק של החולדה: עירוי ארוך טווח לעורק המסטרי העליון

The superior mesenteric artery can be cannulated in humans through minimally invasive radiological catheterization of the femoral or axillary artery. SMA ...