Name: peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לין לורנס אנדרה האן ולתמיכה טכנית, וחברים של ג&#39;נקינס המעבדה לעזרה בפיתוח של פרוטוקול זה.

1. בידוד תא מרקמת הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של הקרח הקר cEHAA (2-mercaptoethanol EHAA + 10%, עט / סטרפטוקוקוס, gentamycin, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 55 מ&quot;מ FBS) או בינוני תא אחר שווה ערך T, לצלחת התרבות 60 מ&quot;מימ המכילה ריבוע קטן של רשת 100 מיקרומטר ניילון ומניח...

<ol>
	<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo.">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+epitope-specific+T+cells.">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li><li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+memory+CD4++T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance.">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li><li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8++T+cell+lineage+commitment.">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li><li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+repertoire:+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis.">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4(+)+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li><li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses.">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li><li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+naive+CD8++T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection.">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li><li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide/major+histocompatibility+complex+multimers.">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li><li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+3+domain+mutants+of+peptide/MHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells.">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li><li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining.">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li><li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4++T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire.">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li><li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4++T+Cell+Populations.">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li><li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans.">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li><li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8++T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies.">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li><li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4++T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire.">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li><li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands.">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li><li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent.">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li><li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire.">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li><li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells.">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li></ol>

שיטת pMHC tetramer מבוססת תא ההעשרה הוצגה על ידי פרוטוקול זה היא כלי רב עצמה ללימוד תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר התאים T אנדוגני. השימוש בtetramers pMHC מאפשר זיהוי של תאי T epitope ספציפיים המבוססים ישירות על היכולת שלהם להיקשר TCRs ligands pMHC מאותו מקור. ההעשרה מספקת רמת רגישות כך שאוכלוסי...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; ספק</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE או APC מצומדת pMHC tetramer (או multimer)</td&gt;<td&gt; תוצרת חוקר, המתקבל מליבת tetramer NIH, או נרכשו ממקורות מסחריים</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE microbeads המגנטי מצומדות</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC microbeads המגנטי מצומדות</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טורים מגנטיים LS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS או מגנט QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 או 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; חרוזי ספירת תאים</td&gt;<td&gt; טכנולוגיות חיים</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells

צורך בסיסי לחוקרים הלומדים חסינות אדפטיבית עם במודלי ניסויי vivo הוא יכולת לזהות תאי T המבוססים על קולטן תא T אנטיגן (TCR) הספציפי. שיטות עקיפות רבות זמינות שבחלק ארי של אוכלוסיית תאי T היא מגורה במבחנה עם תאי T epitope ספציפי אנטיגן ספציפי ומזוהים באמצעות המדידה של מענה פונקציונלי כגון הפצה, ייצור ציטוקינים, או ביטוי של סמני הפעלה 1. עם זאת, שיטות אלו רק לזהות תאי T ספציפיים epitope מציגים אחד מפונקציות אפשריות רבות, והם אינם רגישים מספיק כדי לזהות תאי T epitope ספציפיים בתדרים מבשרים נאיביים. אלטרנטיבה פופולרית היא מודל העברת מאמצת TCR המהונדס, שבו תאי T חד שבטיים מעכבר מהונדס TCR הם seeded לתוך מארחי histocompatible ליצור אוכלוסיית מבשר גדולה של תאי T epitope ספציפיים שיכול להיות easily מעקב עם השימוש בנוגדני סמן congenic 2,3. אמנם חזק, שיטה זו סובלת מממצאי ניסויים הקשורים בתדירות לא הפיזיולוגית של תאי T עם ייחוד לepitope 4,5 אחת. יתר על כן, מערכת זו אינה יכולה לשמש כדי לחקור את ההטרוגניות התפקודית של תאי T שיבוטי epitope ספציפיים בתוך אוכלוסיית polyclonal. הדרך האידיאלית ללמוד חסינות אדפטיבית צריכה לערב זיהוי הישיר של תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר תא T אנדוגני בשיטה המייחדת את הספציפיות TCR אך ורק על ידי הכריכה לאותו מקור פפטיד: מתחמי MHC (pMHC). השימוש בtetramers pMHC וcytometry זרימה משיג זאת 6, אך מוגבל לזיהוי של אוכלוסיות בתדירות גבוהה של תאי T epitope ספציפיים נמצאו התרחבות משובטת אנטיגן מושרה הבאה בלבד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שמתאמת את השימוש בtetramers pMHC וMagneטכנולוגיה להעשרת תאי טיק כדי לאפשר זיהוי של תאים מאוד נמוכים תדר epitope ספציפיים T מרקמות עכבר הלימפה 3,7. בעזרת טכניקה זו, ניתן לעקוב אחר אוכלוסיות שלמות מקיף epitope ספציפיים של תאי T אנדוגני בעכברים בכל שלבי התגובה החיסונית.

איור 1 מתאר עלילות cytometry זרימה מייצגות של טחול pMHCII tetramer מועשר ודגימות הלימפה מעכברים נאיביים, בעוד איור 2 מציג נתונים יציגים לעכברים שחוסנו בעבר עם פפטיד הרלוונטי + CFA. gating הסידורי מסיר אירועים לא רצויים autofluorescent ואחרים מניתוח מהסוג CD4 + אוכלוסיות תאי T...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells at JoVE.com

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין מ<em&gt; In vivo</em&gt; מערכות ניסיוניות.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

בידוד של תאי T αβ כפול שליליים מהכליות

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...