Name: peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells at JoVE.com

Yazarlar, bu protokolün geliştirilmesi için yardım Jenkins laboratuar Andre Han ve Lawrence Yen teknik yardım ve üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

1. Lenfoid Doku gelen Hücre İzolasyonu <ol><li> Bir küçük kare ihtiva eden bir 60 mm kültür çanağı, buz cEHAA (EHAA +% 10 FBS, pen / strep, gentamisin, 2 mM L-glutamin, 55 mM 2-merkaptoetanol) ya da diğer eşdeğer T-hücresi orta 1 ml ekleyin buz üzerinde 100 mikron naylon örgü ve yer. </li><li> Fare Euthanize. </li><li> Dalak ve mümkün olduğunca çok sayıda kolayca erişilebilir lenf düğümleri kaldırın. Bunlar en az inguinal, aksiller, brakial, servikal ve mezenterik lenf düğümleri içermel...

<ol>
	<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo.">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+epitope-specific+T+cells.">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li><li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+memory+CD4++T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance.">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li><li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8++T+cell+lineage+commitment.">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li><li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+repertoire:+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis.">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4(+)+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li><li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses.">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li><li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+naive+CD8++T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection.">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li><li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide/major+histocompatibility+complex+multimers.">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li><li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+3+domain+mutants+of+peptide/MHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells.">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li><li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining.">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li><li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4++T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire.">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li><li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4++T+Cell+Populations.">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li><li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans.">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li><li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8++T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies.">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li><li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4++T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire.">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li><li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands.">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li><li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent.">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li><li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire.">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li><li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells.">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li></ol>

Bu protokol tarafından sunulan pMHC tetramer tabanlı cep zenginleştirme yöntemi endojen T hücre çizgilerinden epitop-spesifik T hücreleri incelemek için güçlü bir araçtır. PMHC tetramerleri kullanımı, doğrudan doğruya aynı kökten gelen pMHC ligandlar bağlamak için kendi TCRS yeteneğine dayalı epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlar. Zenginleştirme antijen-spesifik T hücrelerinin çok nadir topluluğunun, genetik ya da haberci frekans herhangi bir düzenlemesi olmadan T hücrelerinin e...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reaktif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Bayilik</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE veya APC konjuge pMHC tetramer (veya multimer)</td&gt;<td&gt; NIH tetramer çekirdek elde, araştırmacı tarafından yapılmış, ya da ticari kaynaklardan satın</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE konjuge manyetik mikroboncukları</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC konjuge manyetik mikroboncukları</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS manyetik sütunlar</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS veya QuadroMACS mıknatıs</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 veya 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hücre sayımı boncuk</td&gt;<td&gt; Yaşam Teknolojileri</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells

Vivo deneysel modellerde olan adaptif bağışıklık inceleyen araştırmacılar için temel bir gereklilik kendi T hücre antijen reseptör (TCR) özgüllük esas T hücreleri belirlemek için bir yetenek. Pek çok dolaylı yöntemlerle T-hücrelerinin bir yığın nüfus belirli bir antijen ile epitopu özgü T hücreleri proliferasyonu, sitokin üretimi, ya da aktivasyonu 1 ifadesi olarak işlevsel bir yanıt ölçümü ile tespit edilir ile in vitro uyarılmış olduğu kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birçok olası fonksiyon gösteren bir epitopuna özgü T hücreleri belirlemek, ve saf haberci frekanslarda epitopa spesifik T hücreleri saptamak için yeterli değildir. Popüler bir alternatif, TCR transjenik adoptif aktarım modeli olan bir TCR transjenik fare monoklonal T hücreleri EASI olabilir epitopa spesifik T-hücrelerinin geniş bir haberci nüfus oluşturmak için histocompatible taşıyıcılara yerleştirildiği tohumlanmıştırly bir congenic işaretleyici antikor 2,3 kullanımı ile izlenir. Güçlü olmakla birlikte, bu yöntem, 4,5, tek bir epitopu için spesifikliğe sahip olan T hücrelerinin unphysiological frekansı ile ilişkili deneysel eser uğrar. Ayrıca, bu sistem, bir poliklonal popülasyon içindeki epitopa spesifik T hücre klonlarının fonksiyonel heterojen araştırmak için kullanılamaz. MHC (pMHC) kompleksleri: kazanılmış bağışıklık incelemek için ideal bir şekilde sadece kendi akraba peptid bağlayıcı ile TCR özgüllük ayıran bir yöntem kullanılarak, endojen T-hücresi epitopu repertuarından-spesifik T hücrelerinin doğrudan saptanması içermelidir. PMHC tetramerleri ve akış sitometrisi kullanımı bu 6 gerçekleştirir, ancak şu antijen kaynaklı klonal büyüme bulunamadı epitopa spesifik T-hücrelerinin yüksek frekans popülasyonlarının tespiti ile sınırlıdır. Bu protokol, bir pMHC tetramerleri kullanımı ile koordine yöntem ve magnezyum tanımlamaktik hücre zenginleştirme teknoloji fare lenf dokuları 3,7 son derece alçak frekans epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlamaktır. Bu teknik sayesinde, bir kapsamlı immün yanıtın tüm aşamalarında farelerde endojen T hücrelerinin tamamı epitop özel popülasyonlarda izleyebilirsiniz.

Şekil 2&#39;de daha önceden ilgili peptid + CFA ile bağışık hale getirilen farelerin için temsilci veriler göstermektedir iken Şekil 1, saf farelerden alınan pMHCII tetramer zenginleştirilmiş dalak ve lenf düğümü numuneleri için temsili akış sitometrisi parselleri göstermektedir. Seri yolluk CD4 analizi + T hücre popülasyonlarının gelen autofluorescent ve diğer istenmeyen olaylar kaldırır. CD8 + T hücre populasyonunun CD4 pMHCII tetramer boyama + T hücreleri...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells at JoVE.com

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma sağlar<em&gt; In vivo</em&gt; Deneysel sistemler.

Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Böbrek gelen Çift Negatif αβ T Hücreleri İzolasyon

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

T hücrelerinin türetilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Fare Embriyonik Kök Hücreleri

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

Sitokin yakalama Sistemi kullanılarak Klinik Uygulamalar için Sitomegalovirüs özgü otomatik Hücre Zenginleştirme T hücreleri

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

T hücreleri dendritik hücreler gelen Transinfection tarafından Bakteriler Yakalama

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...