Name: isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by fluorescence activated cell sorting (facs)
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00
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Wir danken Dr. Yitzchak Oschry und Dr. Orit Sagi-Asif für ihre Hilfe bei FACS-Sortierung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien an NE von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung n unterstützt ° [276890], aus dem Israel Cancer Association (# 20110078), und aus dem Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).

Ein. Sezieren Mammary oder Skin Gewebe von Mäusen <ol><li> Vor der Zerlegung des gewünschten Gewebe von Mäusen, bereiten Sie die folgenden Lieferungen und Reagenzien: Supplies: <ul><li> Chirurgische Werkzeuge (gewaschen mit Reinigungsmittel getaucht und dann in 70% Ethanol). </li><li> Styropor Oberfläche mit der Maus auf beim Präparieren ruhen. </li><li> Pins oder Nadeln an Mäusen während der Präparation zu halten. </li><li> Glas mit Deckel für die Verdauung, mit Magnetrührstab (aut...

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	<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors.">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. 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Während Versuche in Zellkultur durchgeführt kann informativ und schlagen Funktionsprinzipien, die in vivo nachgewiesen werden kann, ist es bekannt, dass große Veränderungen in der Genexpression von Zellen in Kultur 11,12. Um eine Gewebekultur Schritt vermeiden beim Profilieren Genexpression in Fibroblasten, entwickelten wir ein Protokoll, das Isolierung von normalen, sowie Krebs assoziierten Fibroblasten aus frischen Maus oder menschlichen Gewebe. Ermöglicht Dieses Protokoll wurde erfolgreich mi...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Name des Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;<td<strong&gt; Kommentare (optional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; Biological Industries</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagenase II</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IV Collagenase</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cell Sieb 70 um</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Purified anti-Maus CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Via Sonde (7AAD)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Maus-CD140a-PE (PDGFRA)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Maus-F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o Phenolrot</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollagen Typ I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by fluorescence activated cell sorting (facs)

Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAF) sind die bekanntesten Zelltyp innerhalb des Tumorstroma vieler Krebsarten, insbesondere Mammakarzinomen, und ihre höchste Präsenz wird oft mit einer schlechten Prognose assoziiert 1,2. CAF sind aktiviert Subpopulation von Stromafibroblasten, Ausdruck von denen viele die Myofibroblasten Marker α-SMA 3. CAF stammen vom lokalen Gewebe Fibroblasten sowie aus Knochenmark stammende Zellen rekrutiert in die sich entwickelnde Tumoren und Annahme eines CAF Phänotyp unter dem Einfluß des Tumormikroumgebung 4. CAF wurde gezeigt, dass Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass fördert die Proliferation von Tumorzellen, die Angiogenese und Invasion 5-8 erleichtern. Wir haben gezeigt, dass CAF Tumorwachstum verstärken durch Vermittlung tumorpromovierenden Entzündungen, ab den frühesten präneoplastische Stufen 9. Trotz der zunehmenden Nachweis der Schlüsselrolle CAF spielen bei der Förderung des Tumorwachstums,Studium CAF wurde ein fortlaufender Herausforderung aufgrund der mangelnden CAF-spezifische Marker und die überwiegende Heterogenität dieser Zellen, mit vielen Subtypen koexistierenden im Tumormikromilieu 10. Außerdem prüft Fibroblasten in vitro durch die Tatsache, dass ihre Genexpressionsprofils oft in Gewebekultur 11,12 verändert behindert. Um dieses Problem anzugehen und unvoreingenommene Genexpressionsanalysen von Fibroblasten aus frischen Maus und menschlichen Geweben zu ermöglichen, entwickelten wir ein Verfahren bei früheren Protokollen für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) 13,14 basieren. Unser Ansatz beruht auf der Nutzung PDGFRα als Oberflächenmarker zu Fibroblasten aus frischen Maus und menschlichem Gewebe zu isolieren. PDGFRα ist reichlich von beiden normalen Fibroblasten und CAF 9,15 ausgedrückt. Diese Methode erlaubt die Isolierung von reinem Populationen von normalen Fibroblasten und CAF, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt α-SMA + aktiviert Myofibroblasten. Isolierte Fibroblasten können dannverwendet für die Charakterisierung und Vergleich der Entwicklung der Genexpression, die in der Tumorgenese CAF auftritt. Tatsächlich berichteten wir und andere Expression Profiling von Fibroblasten durch Zellsortierung 16 isoliert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich durchgeführt zu isolieren und zu profilieren hochangereichertes Populationen von Fibroblasten aus der Haut, Brust-, Pankreas-und Lungengewebe. Außerdem unserer Methode können auch Kultivieren von sortierten Zellen, um funktionelle Experimente durchzuführen und um die Kontamination durch Tumorzellen, die oft eine große Hürde beim Versuch Kultur CAF vermeiden.

Verwendung PDGFRα als Marker für Fibroblasten führt Isolierung von hochangereicherten Populationen von Gewebe Fibroblasten. Der Reinheitsgrad nach der Sortierung betrug 99%, wie durch post-sort-Analyse (2A) quantifiziert. Schätzen der Prozentsatz der nicht-kontaminierenden Fibroblastenzellen durch die relative Expression von zellspezifischen Kontrollgene (2B) zeigt typischerweise 0,1-0,6% Verunreinigung. Diese Reinheit ermöglicht hohe Qualität Transkriptom-Profiling von isolierten...

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Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Krebs Fibroblasten (CAF) zu erleichtern Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass es fördert die Proliferation, Angiogenese und Entzündung. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um reine Populationen normalen Fibroblasten und CAF aus frischen Maus und menschlichen Geweben isolieren durch Zellsortierung unter Verwendung PDGFRα als Oberflächen-Marker.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

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Isolierung und Reinigung von Drosophila Peripheren Neuronen durch Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Forschung

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

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Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

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Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling und anschließende Fluorescence Activated Cell Sorting für Kultur-unabhängige Identifizierung von gelöstem organischem Kohlenstoff abbauenden Bakterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

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Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch<em&gt; In-situ</em&gt; Leberperfusion

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

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After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

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Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

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Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

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During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

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