Name: isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by fluorescence activated cell sorting (facs)
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS at JoVE.com

Biz FACS sıralama ile yardım için Dr Yitzchak Oschry ve Dr Orit Sagi-Asif ederim. Bu araştırma hibe sözleşmesi n kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) NE hibe tarafından desteklenen ° [276.890], İsrail Kanser Derneği (# 20110078), gelen ve İsrail Kanser Araştırma Fonu (Research Kariyer Geliştirme Ödülü).

1. Fare gelen Meme veya Deri Doku Diseksiyon <ol><li> Farelerin istenilen doku diseksiyon önce, aşağıdaki sarf malzemeleri ve reaktifler hazırlamak: Malzemeleri: <ul><li> Cerrahi araçları (deterjan ile yıkandı ve daha sonra% 70 etanol içinde batırılmış). </li><li> Strafor yüzey diseksiyonu sırasında fare dinlenmek için. </li><li> Veya iğne diseksiyonu sırasında fare tutun. </li><li> Manyetik karıştırıcı (otoklav) içeren sindirim için kapaklı cam kavanoz,. </li><li...

<ol>
	<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+cancer.">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression.">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li><li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors.">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li><li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players.">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 19, 67-73 (2009).</li><li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer.">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li><li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression.">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li><li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1/CXCL12+secretion.">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li><li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+interactions+with+the+tumor+stroma.">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li><li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner.">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts.">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research &amp; therapy. 12, R83 .</li><li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+mitotic+clock+or+culture+shock.">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li><li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation:+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response.">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li><li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting.">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19 (2008).</li><li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth.">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models.">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).</li><li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts.">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li></ol>

Doku kültüründe gerçekleştirilen deneyler bilgilendirici ve in vivo olarak kontrol edilebilir fonksiyonel ilkeler önermek mümkün olmakla birlikte, bu kültür içinde 11,12 hücrelerde gen ekspresyonunu büyük değişiklikler meydana geldiği bilinmektedir. Fibroblastlar gen ekspresyonu sırasında bir doku kültürü adım önlemek için amacıyla, sağlar taze fare veya insan dokusu normal hem de kanser-kaynaklı fibroblastlann izole edilmesi. Bir protokol gelişmiş Bu protokol başarıyl...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongReaktif&gt; İsim</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar (isteğe bağlı)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41.965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; Biyolojik Sanayi</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollajenaz II</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollajenaz IV</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoksiribonükleaz</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555.899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hücre süzgeç 70 mikron</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Saflaştırılmış anti-fare CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553.142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Via prob (7AAD)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-fare CD140a-PE (PDGFRA)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-fare F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o Fenol Kırmızısı</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kollajen Tip I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354.236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by fluorescence activated cell sorting (facs)

Kanser ile bağlantılı fibroblast (cafs) özellikle göğüs kanseri olmak üzere birçok kanser tümör stroma içinde en önemli hücre türüdürler ve bunların belirgin durum çoğu zaman zayıf prognoz 1,2 ile ilişkilidir. Cafs stromal fibroblastlann bir aktive alt gruptaki olup, bunların çoğu bu myo işaretleyici α-SMA 3 ifade eder. Cafs lokal doku fibroblast yanı sıra kemik iliği kökenli hücrelerin gelişen tümör içine alınmış ve tümör mikro 4 etkisi altında CAF fenotip kabul kaynaklanır. Cafs tümör hücre proliferasyonu, anjiyogenez ve işgali 5-8 teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyümesi ve ilerlemesi kolaylaştırmak için gösterildi. Bu cafs erken ön-neoplastik aşamaları 9 başlayarak, tümör terfili iltihap aracılık ederek tümör büyümesini artırmak olduğunu göstermiştir. Anahtar rol cafs rağmen artan kanıtlar, tümör büyümesini kolaylaştırmada oynamakokuyan cafs tümör mikro 10 co-mevcut pek çok alt tipi ile CAF-spesifik belirteçler ve bu hücrelerin büyük heterojenliğin eksikliği nedeniyle devam eden bir meydan olmuştur. Üstelik, in vitro olarak fibroblastlar okuyan bunların gen ekspresyonu profiline sıkça doku kültürü 11,12 değiştirildiği gerçeği ile engellenmektedir. Bu sorunu çözmek için ve taze fare ve insan dokularından fibroblastların tarafsız gen ekspresyon profili izin, biz Floresans-Aktif Hücre Ayırma (FACS) 13,14 için daha önceki protokollere dayalı bir yöntem geliştirdi. Bizim yaklaşımımız taze fare ve insan dokusundan fibroblastlar yalıtmak için bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak dayanır. PDGFRα bol, normal fibroblastlar ve cafs 9,15 ikisi tarafından ifade edilir. Bu yöntem de dahil olmak üzere, normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının, izolasyonu ancak α-SMA sınırlı sağlar + miyofibroblastlar aktif. İzole fibroblastlar sonra olabilirkarakterizasyonu ve tümörogenez boyunca cafs meydana gen ifadesinin evrim karşılaştırma için kullanılır. Nitekim, biz ve diğerleri 16 sıralama hücre izole fibroblastların ekspresyon profili bildirdi. Bu protokol başarıyla deri, meme, pankreas ve akciğer dokularından fibroblastların zenginleştirilmiş popülasyonları ayırmak ve profil yapıldı. Bunun yanı sıra, yöntem, aynı zamanda işlevsel deneyler için ve kültür cafs çalışırken sık sık büyük bir engel teşkil tümör hücreleri ile kirlenmesini önlemek üzere, sıralı hücrelerin kültürlenmesi izin verir.

Doku fibroblast zenginleştirilmiş popülasyonlarının izolasyonu fibroblastlar sonuçları için bir belirteç olarak PDGFRα kullanma. Sıralama sonrasında saflık düzeyi gibi post-tür analizi (Şekil 2A) ile ölçülebilir,% 99 idi. Hücre özel kontrol genlerinin göreceli ifadesi (Şekil 2B) ile non-fibroblast hücreleri kirletici yüzdesi tahmin edilmesi tipik olarak% 0.1-0.6 kirlenme göstermektedir. Saflık Bu düzeyde izole fibroblastlar 9 yüksek kalitede trans...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS at JoVE.com

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Kanser İlişkili Fibroblastlar (cafs) proliferasyon, anjiyogenez ve inflamasyon teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyüme ve ilerlemesini hızlandırabilir. Burada bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak hücre sıralama ile taze fare ve insan dokularında normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Etiketleme ve Çözünmüş Organik Kültür bağımsız Kimlik sonraki Floresan Aktive Hücre Sıralama Karbon-aşağılayıcı Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Sıçan Portal Fibroblastlar izolasyonu ile<em&gt; Yerinde</em&gt; Karaciğer Perfüzyon

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Dev Virüs Karışım Ayırma için Floresan-Aktive Hücre Sıralama alternatif bir strateji olarak Tek Hücreli Mikro-aspirasyon

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Skleraktin Hücre Popülasyonlarının İzolasyoniçin Floresan-Aktive Hücre Sıralaması

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...