Name: long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination
Uploaded: 2012-12-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination Video at JoVE.com

Agradecemos Amanda Rychel de assistência no desenvolvimento do lapso de tempo de protocolo e Lynn Pillitteri para a construção de POLAR :: POLAR-eGFP. Agradecemos também a ABRC para fornecer a pm rb-construir. Este protocolo foi desenvolvido através de um suporte da adjudicação PRESTO do Japão Ciência, Tecnologia e Agência. Pesquisa sobre POLAR também foi apoiado pela Universidade de Washington Royalty Research Fund (RRF-4098) e da National Science Foundation (MCB-0855659). KMP é um NSF graduação Bolseiro de Investigação (DGE-0718124), e KUT é um investigador HHMI-GBMF.

1. Esterilização de sementes <ol><li> Preparar a solução de esterilização de sementes: lixívia 33%, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Coloque as sementes que transportam construção repórter fluorescente desejada (s) e genótipo (s) em 1,7 ml de tubo e aplicar 1 ml da solução de esterilização. Incubar em Nutator durante 15 min. </li><li> Em um capuz estéril, utilizar uma pipeta para remover a solução de esterilização a partir do tubo, deixando atrás de sementes. Enxágüe com 1 ml de água estéril. R...

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64 (1983).</li><li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A., Bate, M., Martinez Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Mitosis+and+Morphogenesis:+Point+and+Counterpoint.">Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint.</a> Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development.">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449 (1995).</li><li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inz&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854 (2002).</li><li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division,+Cell+Growth,+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis.">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74 (2004).</li><li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. 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O. r. t. i. z. -., C, J., Kybic, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consistent+and+Elastic+Registration+of+Histological+Sections+Using+Vector-Spline+Regularization.">Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization.</a> Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science. 4241, 85-95 (2006).</li><li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+of+the+Mouths+of+Plants:+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development.">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296 (2010).</li><li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -. Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum.">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011 (2007).</li><li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem.">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619 (2006).</li></ol>

Esta técnica de lapso de tempo confocal permite estudos longitudinais de expressão da proteína fluorescente etiquetado e localização em células individuais da epiderme cotilédone Arabidopsis, que, no caso de proteínas e de outros POLARES dinamicamente variáveis ​​é fundamental para uma boa compreensão da sua função. Anteriormente, sustentado de tempo de imagem lapso foi utilizado para examinar a infecção fúngica da raiz de Arabidopsis 11 e meristema 5,12 cresci...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> Uma câmara-de slides </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> Ou duas câmaras (155.379) </td></tr><tr><td> Microscópio de varredura a laser confocal </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> Software Zen 2009 </td></tr><tr><td> 20x lente objetiva </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0,8, Plano-Apochromat </td></tr><tr><td> Dissecando microscópio </td><td> Benz (Nacional) </td><td> 431TBL </td><td> Acende-se a partir de baixo </td></tr><tr><td> º 5 fórceps, biologia ponta </td><td> Roboz instrumento cirúrgico </td><td> RS-4978 </td><td> Dicas muito finassão críticas </td></tr></tbody></table>

long-term, high-resolution confocal time lapse imaging of arabidopsis cotyledon epidermis during germination

Imagiologia in vivo na dinâmica do comportamento celular ao longo de uma sequência de desenvolvimento pode ser uma técnica eficaz para a compreensão dos mecanismos da padronização do tecido. Durante o desenvolvimento do animal, a proliferação celular e os eventos chave padronização ocorrer muito rapidamente. Por exemplo, em Caenorhabditis elegans todas as divisões celulares necessários para o plano do corpo larval são concluídas dentro de seis horas após a fertilização, com sete ciclos mitóticos 1; as mitoses 16 ou mais de embriogênese Drosophila ocorrer em menos de 24 horas 2. Em contraste, as divisões celulares durante o desenvolvimento da planta é lenta, tipicamente da ordem de um dia 3,4,5. Isso impõe um desafio único e uma necessidade de longo prazo de imagem ao vivo para documentar comportamentos dinâmicos de divisão celular e diferenciação eventos durante a organogênese planta. Epiderme Arabidopsis é um sistema excelente modelo para sinalização de investigação, o destino de células e desenvolvimento em plantas. No cotilédone, este tecido é constituída por ar e as células resistentes à água do pavimento intercalados com estômatos uniformemente distribuída, válvulas que abrem e fecham para controlar as trocas gasosas e a perda de água. O espaçamento adequado dos estomas estes é crítico para a sua função, e o seu desenvolvimento segue uma sequência de divisão assimétrica e etapas de diferenciação de células da epiderme para produzir organizada (Fig. 1). Este protocolo permite a observação de células e proteínas na epiderme ao longo de vários dias de desenvolvimento. Este intervalo de tempo permite a documentação precisa de células-tronco divisões e diferenciação das células epidérmicas, incluindo estômatos e células epidérmicas pavimento. As proteínas fluorescentes podem ser fundidos com proteínas de interesse para avaliar a sua dinâmica durante a divisão celular e processos de diferenciação. Esta técnica permite compreender a localização de uma nova proteína, POLAR 6, durante a fase de proliferação de células da linhagem estomática-in the Arabidopsis epiderme cotilédone, onde é expresso em células de eventos anteriores de divisão assimétricos e move-se para uma área característica do córtex célula ocorre pouco antes da divisão. As imagens podem ser registrados e vídeo simplificada facilmente produzida usando o software de domínio público para visualizar localização de proteínas dinâmica e tipos celulares como eles mudam com o tempo.

<html> Um conjunto de pontos de tempo recolhidos informativos com este método é apresentado na Figura 3. As membranas celulares são marcados com RFP (pm-rb) e GFP é fundido com a proteína POLAR sob seu promotor nativo (POLAR :: POLAR-GFP) 6 Na escala de tempo de 30 min, vemos as divisões celulares, juntamente com as mudanças na localização de proteínas precedendo eles. Assimétricos divisões celulares na forma linhagem estomática em células-tronco como precursores estomat...

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Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination Video (Video) | JoVE

Nós descrevemos um protocolo com lâminas de câmara e de mídia para imobilizar cotilédones de plantas para imagem confocal da epiderme durante vários dias de desenvolvimento, documentação diferenciação estomática. Proteínas fluoróforo com a tag pode ser monitorado de forma dinâmica por expressão e localização subcelular, aumentando a compreensão de seus possíveis papéis durante a divisão celular e diferenciação do tipo de célula.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Research

JoVE Journal

Biology

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy Video (Video) | JoVE

Longo prazo células de mamíferos utilizando imagens do Largo-Campo Microscopia

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos Video (Video) | JoVE

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection Video (Video) | JoVE

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy Video (Video) | JoVE

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response Video (Video) | JoVE

Usando scanners de mesa para coletar imagens de alta resolução tempo decorrido da Arabidopsis Root gravitrópico Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells Video (Video) | JoVE

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor Video (Video) | JoVE

Gravação em tempo real na Vivo de Arabidopsis sinais de cálcio durante a alimentação de insetos usando um biossensor fluorescente

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis Video (Video) | JoVE

Combinando células mitóticas sincronização e microscopia Confocal de alta resolução para estudar o papel das proteínas Multifunctional ciclo celular durante a mitose

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging Video (Video) | JoVE

Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy Video (Video) | JoVE

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...