Name: quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative FRET FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination at JoVE.com

ونحن ممتنون جدا لفيكتور GJ رودجرز للمشورة قيمة. نشكر جميع أعضاء الفريق لياو للعمل التعاوني وثيقة للغاية وللمساعدة في هذه الدراسة. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنح AI076504 لJL).

1. بلازميد التركيبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم الإطارات القراءة مفتوحة من الجينات بواسطة PCR، واستنساخ المنتجات PCR-TOPO PCRII في ناقلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد المنتجات من قبل التسلسل، واستنساخ [كدنا] الترميز CyPet-(قبل SUMO1)-YPet، CyPet SUMO1، و...

<ol>
	<li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+By+SUMO.">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 18, 2046-2059 (2004).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li><li>M&#252;ller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO,+ubiquitin's+mysterious+cousin.">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP-RING+for+SUMO:+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein.">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li><li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeSUMOylating+enzymes-SENPs.">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li><li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+in+reverse:+the+SUMO+proteases.">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li><li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates.">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond.">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li><li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein.">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li><li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Ubiquitin-related+Modifier+(SUMO)-specific+Proteases:+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs.">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li><li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes.">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li><li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+(SENPs)+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family.">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461 (2008).</li><li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity.">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li><li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing.">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li><li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET.">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li></ol>

تم استخدام التكنولوجيا الحنق لدراسة ما قبل النضج SUMO1 من قبل SENP1 9. وقد استخدم CFP-YFP حيث يتحرك هذا الزوج الحنق وتحليل ratiometric، والتي هي نسبة انبعاثات متقبل لالمانحة، تم استخدامه لوصف خصائص الحركية. ومع ذلك، لا يوجد أي النظر في الجهات المانحة ومتقبل الذاتي مضان في ratiom...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> PCR الثاني TOPO كيت </td><td> إينفيتروجن </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> البحث منتجات شركة Internationa.l </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> ني NTA Agrose </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie الجمع (برادفورد) ريجنت الفحص </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384 لوحة جيدا (أسفل الزجاج) </td><td> غرينر </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 قارئ لوحة </td><td> الجزيئية الأجهزة </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination

وتستخدم على نطاق واسع تعديلات ما بعد النقل عكسها من البروتينات مع البروتينات مثل اليوبيكويتين أو اليوبيكويتين-(Ubls) لتنظيم نشاط حيوي البروتين وأدوار متنوعة في العديد من العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، SUMO يعدل تساهميا عدد كبير أو البروتينات مع أدوارا هامة في العديد من العمليات الخلوية، بما في ذلك الخلايا دورة التنظيم وبقاء الخلية والوفاة، استجابة DNA الأضرار، والإجهاد استجابة 1-5. SENP، وSUMO محددة البروتيني، تكون بمثابة ببتيداز داخلية في نضوج السلائف SUMO أو باعتبارها isopeptidase لإزالة SUMO من البروتينات هدفه وتحديث دورة SUMOylation 1،3،6،7. ويتميز كفاءة الحفاز أفضل أو خصوصية انزيم من نسبة الثوابت الحركية، ك القط / M K. في العديد من الدراسات، وقد تم تحديد المعلمات الحركية للSUMO-SENP أزواج بطرق مختلفة، بما في ذلك على أساس هلام بولكرلميد الغربي صمة عار، رادioactive التي تحمل علامات المسمى الركيزة، مجمع الفلورسنت أو البروتين الركيزة 8-13. ومع ذلك، فإن تقنيات بولكرلميد هلام القائم، والتي تستخدم في &quot;الأم&quot; هي بروتينات ولكن شاقة وتطالب من الناحية الفنية، التي لا تخضع بسهولة لأنفسهم التحليل الكمي مفصلة. وحصلت ك القط / M K من الدراسات التي تستخدم tetrapeptides أو البروتينات مع ACC (7-الأمينية-4-carbamoylmetylcoumarin) أو AMC (7-الأمينية-4-methylcoumarin) fluorophore إما يصل الى اثنين من أوامر من حجم أقل من ركائز الطبيعية أو لا يمكن التمييز بوضوح على شهادة الأيزو والأنشطة ببتيداز داخلية من SENPs. واستخدمت مؤخرا فحوصات البروتيني، الحنق القائم على دراسة الأنزيمات deubiquitinating (يصف) أو SENPs مع الزوج الحنق من بروتين فلوري سماوي (CFP) وبروتين فلوري الصفراء (YFP) 9،10،14،15. تم استخدام نسبة الانبعاثات إلى الانبعاثات متقبل المانحة كمعلمة الكمية لرصد الحنق إشارة لميلان البروتينيtivity المصير. ومع ذلك، تجاهل هذا الأسلوب إشارة عبر التلوث ومتقبل في موجات من الانبعاثات المانحة ومتقبل المانحة الذاتي مضان وبالتالي لم يكن دقيقا. وضعنا رواية شديدة الحساسية والكمية الفحص البروتيني الحنق القائم لتحديد معالم الحركية في مرحلة ما قبل النضج SUMO1 من SENP1. وهندسيا الحنق CyPet الزوج وYPet بكفاءة الحنق تحسنت بشكل ملحوظ ومضان العائد الكم، واستخدمت لتوليد CyPet-(قبل SUMO1)-YPet الركيزة 16. نحن متباينة وكميا إشارات مضان المطلقة ساهمت من قبل الجهة المانحة ومتقبل والحنق على موجات متقبل والانبعاثات على التوالي. تم الحصول على قيمة القط ك / M K ك (3.2 ± 0.55) X10 7 M -1 ق -1 من SENP1 نحو SUMO1 المسبق، وهو ما يتفق مع المعايير العامة الحركية الأنزيمية. لذلك، هذه المنهجية صالحة ويمكن استخدامSA النهج العام لتوصيف البروتياز الأخرى كذلك.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative FRET FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination at JoVE.com

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

يوصف أسلوب الرواية التي تنطوي على التحليل الكمي من الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) إشارات لدراسة حركية الانزيم.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; و<em&gt; ك<sub&gt; القط</sub</emتم الحصول على&gt; لفي المجال المائي الحفاز SENP1 (سومو / Sentrin البروتيني محددة 1) إلى ما قبل SUMO1 (صغير اليوبيكويتين مثل التعديل). ويمكن تطبيق المبادئ العامة لهذه الدراسة البروتيني الحركية الكمية-الحنق القائم على البروتياز الأخرى.

الكمية الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) تحليل لتحديد حركية SENP1 البروتياز

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Bioengineering

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Unit 1

Work and Kinetic Energy

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

تحسن التصور والتحليل الكمي لتأثيرات الدواء باستخدام خلايا Micropatterned

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

التصاق الفحص عن التردد في الموقع تحليل حركية عبر صلي التفاعلات الجزيئية في خلية واجهة سيل

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; &#39;تنقل

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

المخدرات التي يسببها-توعية انزيمات محلقة: تبسيط الفحص والتصغير لجزيء صغير وسيرنا تطبيقات الفحص

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

نقل التلألؤ الرنين الطاقة لدراسة التغييرات بتكوين جزئي في غشاء البروتينات أعرب في خلايا الثدييات

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

قياس TCR-PMHC التجليد<em&gt; في الموقع</em&gt; باستخدام الميكروسكوب الفحص القائم على الحنق

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

متعدد الألوان كشف الإسفار عن القطرة على microfluidics عن طريق الألياف البصرية

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

الاعتراف الجزيئية والهندسة مع البوليمرات الحيوية المحاكاة على واحدة المسورة الكربون الأنابيب النانومترية

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...