Name: quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00
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私たちは、貴重なアドバイスのためにビクターGJロジャースに大変感謝しております。我々は非常に密接な共同作業のために、この研究のヘルプは遼グループのすべてのメンバーに感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所（JLにグラントAI076504）によってサポートされていました。

1。プラスミド構築<ol><li> PCRにより遺伝子のオープンリーディングフレームを増幅し、PCRII-TOPOベクターにPCR産物をクローニングします。 </li><li>配列決定することによって製品を確認して、クローンをコードするcDNA CyPet-（プリSUMO1）YPet、CyPet-SUMO1、YPetおよびN-末端ヒスチジンタグ付きpET28（b）のベクトルにSENP1の触媒ドメイン。 </li></ol> 2。タンパク質の発現と精製<ol><li> p...

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	<li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+By+SUMO.">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 18, 2046-2059 (2004).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li><li>M&#252;ller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO,+ubiquitin's+mysterious+cousin.">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP-RING+for+SUMO:+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein.">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li><li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeSUMOylating+enzymes-SENPs.">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li><li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+in+reverse:+the+SUMO+proteases.">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li><li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates.">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond.">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li><li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein.">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li><li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Ubiquitin-related+Modifier+(SUMO)-specific+Proteases:+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs.">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li><li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes.">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li><li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+(SENPs)+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family.">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461 (2008).</li><li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity.">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li><li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing.">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li><li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET.">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li></ol>

FRET技術はSENP1 9でプリSUMO1の成熟を ​​研究するために使用されています。 CFP-YFPは、ドナー·アクセプターへの排出量の比率であるFRETペアとレシオメトリック分析、として使用された速度論的性質を特徴づけるために使用されていました。しかし、伝統的なレシオメトリックでの自己蛍光がFRET分析ドナーとアクセプターのは考慮されていません。比は、直接消化された基質の量と?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> PCR II TOPOキット</td><td>インビトロジェン</td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td>リサーチ製品Internationa.l株式会社</td><td> X15600 </td></tr><tr><td>のNi-NTAアガロース</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 88222 </td></tr><tr><td>クマシープラス（ブラッドフォード）アッセイリージェント</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384ウェルプレート（ガラスボトム） </td><td>グライナー</td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384プレートリーダー</td><td>分子素​​子</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination

ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質（Ubls）を持つタンパク質の可逆的翻訳後修飾は、広く動的にタンパク質の活性を調節し、多くの生物学的プロセスで多様な役割を持っているために使用されます。たとえば、SUMOは共有結合で細胞周期調節、細胞の生存と死、DNA損傷応答、ストレス応答1月5日を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を持つ大規模な番号またはタンパク質を変更します。 SUMO特異的プロテアーゼとしてSENP、SUMO前駆体の成熟にエンドペプチダーゼとして、あるいはその標的タンパク質からSUMOを削除し、SUMO化サイクル1,3,6,7をリフレッシュするイソペプチダーゼとして機能します。 酵素の触媒効率や特異性は、最高の速度定数は、k 猫 / K Mの比であることを特徴とする。いくつかの研究では、SUMO-SENPペアの速度論的パラメータは、RAD、ポリアクリルアミドゲルベースの​​ウェスタンブロットを含む様々な方法によって決定された基板8から13というラベルの付いたioactive標識基質、蛍光化合物またはタンパク質。しかし、 &quot;ネイティブ&quot;のタンパク質を使用しましたが、ポリアクリルアミドゲルベースの​​技術は、面倒で技術的に厳しいですが、その容易に詳細な定量分析には役立たない。 （7 -アミノ-4 - carbamoylmetylcoumarin）[ACC]またはAMC（7 -アミノ-4 -メチルクマリン）蛍光体でテトラペプチドまたはタンパク質を用いた研究から得られたK 猫 / K M天然の基質よりも低い二桁までのいずれかであったまたは明らかにiso-およびSENPsのエンドペプチダーゼの活動を区別することはできません。 最近では、プロテアーゼアッセイと脱ユビキチン化酵素（ダビング）またはSENPsを勉強するために使用されたベースがFRETは、シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）9,10,14,15のFRETペア。プロテアーゼAC用信号モニタのFRETのドナー発光に対するアクセプター発光の比率は、定量的なパラメータとして使用されましたtivity決定。しかし、この方法では、アクセプターとドナーの自己蛍光によるアクセプターとドナーの発光波長での信号のクロスコンタミネーションを無視し、したがって、正確ではありませんでした。 我々はSENP1によってプリSUMO1成熟の速度論的パラメータを決定するための新規高感度かつ定量的なFRETベースプロテアーゼアッセイを開発しました。工学的には、大幅に改善FRET効率と蛍光量子収率とペアCyPetとYPetのFRET CyPet-（プリSUMO1）YPet基板16を生成するために使用された。私たちは、差別やドナーとアクセプターが寄与するとそれぞれ、アクセプターおよび発光波長でFRETが絶対的な蛍光シグナルを定量化した。 K 猫 / K Mの値は（3.2±0.55）として得た一般的な酵素の速度論的パラメータと一致しているプレSUMO1、向かってSENP1のx10の7 M -1 s -1で 。したがって、この方法は有効であり、使用することができます同様に他のプロテアーゼを特徴付けるためのSAの一般的なアプローチ。

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Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

FRETの定量分析（フェルスター共鳴エネルギー転移）信号を含む新規な方法は、酵素反応速度論を研究するために記述されている。<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt;と<em&gt; K<sub&gt;猫</sub</em&gt;は（ユビキチン類似因子）プリSUMO1へSENP1（SUMO / Sentrin特異的プロテアーゼ1）の触媒ドメインの加水分解が得られた。この量的-FRETベースプロテアーゼ動態検査の一般的な原理は、他​​のプロテアーゼに適用することができます。

SENP1プロテアーゼキネティクス決定のための定量的なFRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）の分析

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

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Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

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マイクロパターン細胞を用いた薬物の効果の改善可視化と定量分析

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

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のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; &#39;ロコモーション

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

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アデニリルシクラーゼの薬物誘発性感作：アッセイは、小分子およびsiRNAスクリーニング用途のために合理化·小型化

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

TCR-のpMHCが結合を測定します<em&gt;その場で</em&gt; FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して

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FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

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Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

原子力LINCコンプレックス全体に機械的な力を測定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）-forceのバイオセンサーを使用するためのプロトコル

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

単層カーボンナノチューブ上のバイオミメティックポリマーとエンジニアリング分子認識

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...