Name: quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative FRET FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination at JoVE.com

우리는 귀중한 조언 빅터 GJ 로저스 매우 감사하고 있습니다. 우리는 아주 가까운 공동 작업에이 연구에 도움 리아 그룹의 구성원 모두들 감사합니다. 이 연구는 국립 보건원 (JL에 부여 AI076504)에 의해 지원되었다.

1. 플라스미드 구조 <ol><li> PCR에 의해 유전자의 오픈 읽기 프레임을 증폭하고, PCRII-TOPO 벡터로 PCR 제품을 복제. </li><li> 시퀀싱하여 제품을 확인하고, 복제 cDNA 인코딩 CyPet - (사전 SUMO1) YPet, CyPet - SUMO1, YPet 및 N-터미널 hexahistidine 태그와 pET28 (b)는 벡터에 SENP1의 촉매 도메인입니다. </li></ol> 2. 단백질 표현과 정화 <ol><li> pET28로 변형 BL21 (DE3)의 대장균 세포를 변환 (B) CyPet - (?...

<ol>
	<li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+By+SUMO.">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 18, 2046-2059 (2004).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li><li>M&#252;ller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO,+ubiquitin's+mysterious+cousin.">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP-RING+for+SUMO:+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein.">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li><li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeSUMOylating+enzymes-SENPs.">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li><li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+in+reverse:+the+SUMO+proteases.">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li><li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates.">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond.">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li><li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein.">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li><li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Ubiquitin-related+Modifier+(SUMO)-specific+Proteases:+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs.">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li><li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes.">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li><li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+(SENPs)+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family.">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461 (2008).</li><li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity.">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li><li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing.">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li><li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET.">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li></ol>

걱정 기술은 SENP1 9 미리 SUMO1의 성숙을 연구하는 데 사용되었습니다. CFP-YFP는 기증자의 배출량에 대한 수용체의 비율입니다 걱정 쌍과 ratiometric 분석으로 사용 된 운동 속성을 특징하는 데 사용되었다. 그러나, 기존의 ratiometric의 자체 형광는 분석을 걱정 기증자와 수용체 전혀 고려가 없습니다. 비율은 직접 소화 기판의 양이 서로 관련이되지 않습니다. 여기 SENP1에 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> PCR II TOPO 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> 연구 제품 Internationa.l 주식회사 </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> 니켈 NTA Agrose </td><td> 열 과학 </td><td> 88,222 </td></tr><tr><td> Coomassie 플러스 (브래드 포드) 검정 리젠트 </td><td> 열 과학 </td><td> 23,238 </td></tr><tr><td> 384 잘 플레이트 (유리 아래) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 판 리더 </td><td> 분자 장치 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination

ubiquitin 또는 ubiquitin 같은 단백질 (Ubls)과 단백질의 치료 posttranslational 수정은 널리 동적으로 단백질의 활동을 조절하고 다양한 생물학적 과정에서 다양한 역할을 수행하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 스모는 covalently 세포주기 조절, 세포 생존과 죽음, DNA 손상 반응 및 스트레스 반응 1-5 등 많은 세포 과정에 중요한 역할을 갖춘 대형 번호 또는 단백질을 수정합니다. SENP는 스모 특정 단백 분해 효소로, 스모 전구체의 성숙에 endopeptidase 또는 isopeptidase의 기능은 대상 단백질에서 스모를 제거하고 SUMOylation주기에게 1,3,6,7를 새로 고칠 수 있습니다. 효소의 촉매 효율이나 특이성은 가장 운동 상수, K 고양이 / K M의 비율이 특징입니다. 여러 연구에서, 스모 - SENP 쌍의 운동 매개 변수가 힘이에요, polyacrylamide 젤 기반 서양 얼룩 등의 다양한 방법에 의해 결정되었습니다ioactive - 라벨 기판, 형광 화합물 또는 단백질이 기판 8-13를 표시. 그러나, &quot;네이티브&quot;단백질을 사용하지만 polyacrylamide - 젤 기반 기술은 힘든 및 기술적 요구이며, 그 즉시 자세한 정량 분석​​에 자신을 빌려하지 않습니다. ACC (7 - 아미노-4-carbamoylmetylcoumarin) 또는 AMC (7 - 아미노-4-methylcoumarin) 형광과 tetrapeptides 또는 단백질을 사용하여 연구에서 K 고양이 / K M을 획득 자연 기판보다 크기 낮은 최대 두 명령 중 하나였다 또는 명확하게 SENPs의 ISO와 endopeptidase 활동을 차별화 할 수 없습니다. 최근, 아가야 기반의 단백 분해 효소 assays는 시안 형광 단백질의 걱정 쌍 (CFP)와 황색 형광 단백질 (YFP) 9,10,14,15과 deubiquitinating 효소 (DUBs) 또는 SENPs을 연구하는 데 사용되었습니다. 단백 분해 효소 교류를위한 신호 모니터를 안달을 위해 기증 방출에 대한 수용체 방출의 비율은 양적 매개 변수로 사용되었다tivity 결정. 그러나,이 방법은 수용체 및 공여체 자기 형광하여 수용체와 기증자 방출 파장에서 신호 교차 contaminations을 무시하기 때문에 정확한 아니 었습니다. 우리는 SENP1에 의해 사전 SUMO1 성숙의 운동 매개 변수를 결정하는 매우 중요한 소설 및 정량 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석을 개발했습니다. 엔지니어링은 크게 향상 걱정 효율성과 형광 양자 수율과 쌍 CyPet 및 YPet을 걱정 CyPet - (사전 SUMO1) YPet 기판 16을 생성하는 데 사용되었습니다. 우리는 차별화와 기증자와 수용체에 의해 공헌 각각의 수용체와 방출 파장에서 걱정 절대 형광 신호를 정량화. K 고양이 / K M의 값은 SENP1의 X10 7 M -1의 -1은 일반적으로 효소 운동 매개 변수 계약에 사전 SUMO1 방면 (3.2 ± 0.55)로 얻은 것입니다. 따라서이 방법은 유효하고 사용할 수 있습니다SA 일반적으로는 다른 프로테아제를 특징 접근한다.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative FRET FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination at JoVE.com

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

걱정의 정량 분석​​ (포스터 공명 에너지 전송) 신호를 포함하는 새로운 방법을 효소 반응 속도론을 연구에 설명되어 있습니다.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt;와<em&gt; K<sub&gt; 고양이</sub</em&gt;은 (작은 Ubiquitin과 같은 수정) 사전 SUMO1에 SENP1 (스모 / Sentrin 특정 단백 분해 효소 1) 촉매 도메인의 가수 분해에 대한 획득했다. 이 양적 - 안달 기반 프로테아제 운동 연구의 일반적인 원리는 다른 프로테아제에 적용 할 수 있습니다.

정량은 SENP1 단백 분해 효소 반응 속도론 결정에 대해 (포스터 공명 에너지 전송) 분석 안달

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Bioengineering

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Unit 1

Work and Kinetic Energy

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

연구

생체공학

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

의 주문형 정량 분석​​을위한 미세 유체 기반 Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em&gt; &#39;로코

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRET 유동 세포 계측법과 Proteopathic의 시드 활동의 민감한 검출

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...