Name: quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative FRET FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination at JoVE.com

Biz değerli tavsiyeler için Victor GJ Rodgers için çok müteşekkiriz. Biz çok yakın ortak çalışma ve bu çalışma ile yardım için Liao grubun tüm üyeleri teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (JL Grant AI076504) tarafından desteklenmiştir.

1. Plazmid Oluşumlar <ol><li> PCR ile genlerin açık okuma çerçeveleri Kuvvetlendirme ve PCRII TOPO-vektörüne klonlanması PCR ürünlerinin. </li><li> Dizilenerek teyit ürünleri, ve klon kodlayan cDNA CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet ve bir N-terminal hexahistidine etiket ile pET28 (b) vektörü içine SENP1 katalitik etki. </li></ol> 2. Protein Ekspresyonu ve Saflaştırılması <ol><li> PET28 ile suşu BL21 (DE3) ve Escherichia coli hücreleri Transform (...

<ol>
	<li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+By+SUMO.">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes &amp; Development. 18, 2046-2059 (2004).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li><li>M&#252;ller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO,+ubiquitin's+mysterious+cousin.">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SP-RING+for+SUMO:+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein.">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li><li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeSUMOylating+enzymes-SENPs.">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li><li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+in+reverse:+the+SUMO+proteases.">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li><li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates.">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li><li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond.">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li><li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein.">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li><li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Ubiquitin-related+Modifier+(SUMO)-specific+Proteases:+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs.">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li><li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes.">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li><li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+(SENPs)+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family.">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461 (2008).</li><li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity.">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li><li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing.">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li><li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET.">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li></ol>

FRET teknoloji SENP1 9 tarafından önceden SUMO1 olgunlaşan incelemek için kullanılmıştır. CFP-YFP, verici ile alıcı emilim oranı olarak FRET çifti ve rasyometrik analizi kullanılmıştır kinetik özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Bununla birlikte, geleneksel rasyometrik içinde kendinden flüoresan analiz FRET verici ve alıcı arasında hiç düşünülmemiştir. Oranı doğrudan sindirilmiş substrat miktarı ile korele değildir. Burada SENP1 ön...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> PCR II TOPO Takımı </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Araştırma Ürünleri Internationa.l Corp </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agrose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie artı (Bradford) Assay Regent </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384-plaka (cam alt) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 plaka okuyucu </td><td> Moleküler Cihaz </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative fret (f&#246;rster resonance energy transfer) analysis for senp1 protease kinetics determination

Ubikitin veya ubikitin-benzeri proteinler (Ubls) ile proteinlerin tersinir posttranslasyonel değişiklikler yaygın olarak dinamik bir protein aktivitesini düzenleyen ve çok biyolojik olarak farklı roller için kullanılır. Örneğin, SUMO kovalent hücre siklusunun regülasyonunda, hücre yaşam ve ölümü, DNA hasar cevabı ve stres yanıtın 1-5 gibi birçok hücresel süreçlerin önemli rolü olan bir büyük numarası veya proteinleri değiştirir. SENP, SUMO-spesifik proteaz olarak, SUMO öncüllerinin olgunlaşmasının endopeptidazla olarak veya isopeptidase gibi fonksiyonları hedef proteinleri SUMO kaldırmak ve sumoilasyon döngüsü 1,3,6,7 yenilemek için. Bir enzimin katalitik etkinliği ya da en iyi seçicilik kinetik sabitler, k kedi / K M oranı ile karakterize edilir. Çeşitli çalışmalarda, SUMO-SENP çiftleri kinetik parametreleri rad, poliakrilamid jel tabanlı western-blot dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle tespit edilmiştirioactive-etiketli substrat, floresan bileşik ya da protein alt tabaka 8-13 etiketli. Ancak, &quot;yerli&quot; proteinleri kullanılır ama poliakrilamid-jel tabanlı teknikler, zahmetli ve teknik olarak zor olan, kolayca ayrıntılı nicel analiz için kendilerini borç yoktur. ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ya da AMC (7-amino-4-methylcoumarin) florofor ile tetrapeptides ya da proteinlerin kullanıldığı çalışmalar k kedi / K M edilen doğal substratlar göre büyüklük daha düşük en fazla iki sipariş ya idi veya açıkça SENPs ve iso-ve endopeptidazla faaliyetleri ayırt edemez. Son zamanlarda, FRET tabanlı bir proteaz deneyleri mavi floresan protein FRET çifti (CFP) ve sarı floresan protein (YFP) 9,10,14,15 ile deubiquitinating enzimler (Dubs) ya da SENPs incelemek için kullanılmıştır. Proteaz ac için sinyal monitör FRET için donör emisyonu alıcı emisyon oranı ölçülebilir bir parametre olarak kullanılmıştırbilirlik belirlenmesi. Bununla birlikte, bu yöntem alıcı ve verici kendi flüoresans ile alıcı ve verici emisyon dalga boyunda çalışan sinyal çapraz bulaşma göz ardı edilir ve böylece doğru değildir. Bu SENP1 ön-SUMO1 olgunlaşma kinetik parametrelerinin belirlenmesi için bir yeni ve son derece hassas kantitatif FRET bazlı Proteaz analiz geliştirilmiştir. Bir tasarlanmış, önemli ölçüde geliştirilmiş FRET verim ve floresan kuantum verimi ile çift CyPet ve YPet FRET CyPet-(pre-SUMO1)-YPet alt tabaka 16 oluşturmak için kullanılmıştır. Biz farklılaşmış ve verici ve alıcı tarafından katkı ve sırasıyla alıcı ve emisyon dalga boylarında FRET mutlak floresans sinyalleri sayılabilir. K kedi / K M değeri SENP1 x10 7 M -1 s -1 genel enzim kinetik parametreler ile uyum içindedir ön SUMO1, karşı (3.2 ± 0.55) olarak elde edildi. Bu nedenle, bu yöntem geçerlidir ve bir de kullanılabilirsa genel hem de diğer proteazlar karakterize yaklaşım.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative FRET FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination at JoVE.com

Quantitative FRET FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

FRET kantitatif analizi (Förster rezonans enerji transferi) sinyalleri içeren bir roman yöntemini enzim kinetiği çalışmaları için tanımlanmıştır.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; Ve<em&gt; K<sub&gt; Kedi</sub</em&gt; (Küçük ubikitin gibi değiştirici) ön SUMO1 için SENP1 (SUMO / Sentrin belirli proteaz 1) &#39;in katalitik alanının hidroliz için elde edilmiştir. Bu kantitatif-FRET bazlı proteaz kinetik çalışma genel ilkeler diğer proteazlar için uygulanabilir.

Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Physics

Bioengineering

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Unit 1

Work and Kinetic Energy

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

TCR-pMHC Bağlama Ölçüm<em&gt; In Situ</em&gt; Bir FRET tabanlı Mikroskopi Assay kullanılarak

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Tek Karbon Nanotüp Bio-mimetik Polimerler ile Mühendislik Moleküler Tanıma

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...