Name: ex vivo live imaging of single cell divisions in mouse neuroepithelium
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium at JoVE.com

Этот исследовательский проект был поддержан Дополнение ARRA, 5 R01 NS056380. Дополнительная поддержка была оказана в рамках основной вирусный вектор и микроскопии Ядро Эмори Neuroscience NINDS Основные средства гранта, P30NS055077. Мы благодарим Эмори трансгенных мышей и генного таргетинга для получения основной линии мышей от GENSAT; Грег Pazour для стабильного SSTR3-GFP IMCD3 клеточной линии, и Брэдли Yoder для Sstr3-GFP лентивирусный построить. Моноклональные антитела были получены из исследований развития гибридом банка, разработанный под эгидой NICHD, и поддерживается Университет Айовы, Отделение биологических наук, Iowa City, IA 52242. Все животные процедуры были одобрены IACUC и комитета по биобезопасности в университете Эмори.

Взрослых мышей усыпляют механические смещения шейных позвонков. Все животные процедуры были одобрены IACUC и комитета по биобезопасности в университете Эмори. 1. Эмбрион поколения <ol><li> Крест тамоксифен индуцируемых Cre линии, CAGGCreER и dsRedCre репортер линии (Tg (CAG-BGEO,-DsRed * MST) 1Nagy)...

<ol>
	<li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube:+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate.">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li><li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons:+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube.">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li><li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube.">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li><li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors.">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li><li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+red:+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells,+embryos,+and+adult+animals.">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li><li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre:+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation/inactivation+in+the+mouse.">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li><li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li><li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olig2++neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo.">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li><li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture.">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li><li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response.">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), (2012).</li><li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy.">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li></ol>

Наши бывшие естественных условиях система дает нам возможность непосредственно наблюдать одну клеточных делений в развивающемся нейроэпителия в реальном времени. В качестве примера мы рассмотрели клеточные деления в мышиных эмбриональных нервной трубки и контролируется либо ?...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>005438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td>
			<td>MMRRC,</td>
			<td>010555-UCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAGGCreER</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>003724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Newborn calf serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-416F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum SD male</td>
			<td>Harlan Bioproducts</td>
			<td>4520</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Hepes</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>17-737E</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sstr3-GFP lentivirus</td>
			<td>Emory Viral Core</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-knife, size 0.025 mm</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62091</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-0-10-C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% petroleum jelly</td>
			<td>Kroger</td>
			<td>FL9958c</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 3D software</td>
			<td>Bitplane AG</td>
			<td>Imaris 7.2.3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated sheep serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210-072</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer</td>
			<td>Lab made</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat monoclonal anti-RFP (5F8)</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>110411</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Arl13b serum</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Olig2</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9610</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonals Pax6</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>Pax6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonalsShh</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>5E1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonals Nkx2.2</td>
			<td>Developmental Hybridoma Bank</td>
			<td>74.5A5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11029</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 350</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11046</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22989</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold anti-fade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo live imaging of single cell divisions in mouse neuroepithelium

Мы разработали систему, которая интегрирует живых изображений флуоресцентных маркеров и культивирования эмбриональных ломтиками нейроэпителия мыши. Мы воспользовались существующими линиями мышей клетки для генетической отслеживания клонов: тамоксифен индуцируемых Cre и линии репортер экспрессирующих Cre DsRed на Cre-опосредованной рекомбинации. Используя относительно низкий уровень тамоксифен, мы были способны индуцировать рекомбинации в небольшое число клеток, что позволяет нам следовать отдельных клеточных делений. Кроме того, мы наблюдали транскрипционный ответ на Еж Соник (Тсс) сигнализации использованием Olig2-EGFP трансгенной линии 1-3 и мы провели мониторинг формирования ресничек путем заражения культурный срез с вирусом выражающие реснички маркером, Sstr3-GFP 4. Для того, чтобы изображение нейроэпителии, мы собрали эмбрионов на E8.5, изолированный нервной трубки, смонтированные нейронных ломтик в надлежащих условиях культивирования в изображения камеры и выполнена покадровой конфокальной микроскопии. Наши бывшиеестественных изображений живых метод позволяет проследить одну клеточных делений оценить относительные сроки формирования первичной реснички и Тсс ответ в физиологически соответствующие образом. Этот способ может быть легко адаптирован использованием различных флуоресцентных маркеров и обеспечивает поле инструментами для контроля поведения клеток на месте и в режиме реального времени.

Здесь мы провели бывших естественных живых изображений одного клеточного деления в E8.5 нейроэпителия мыши. Маркировать отдельные клетки, мы индуцированных Cre рекомбиназу в субпопуляции клеток, содержащих линии Cre репортера, которые выразили DsRed при рекомбинации 5,6 (рис. 3?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium at JoVE.com

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Здесь мы разрабатываем инструменты, необходимые для<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Живого изображения проследить одну клеточных делений у мышей E8.5 нейроэпителия

Экс естественных Живая съемка Одноместный клеточных делений в мышь нейроэпителия

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Несколько мыши нейроанатомической Магнитно-резонансная томография

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Высокое разрешение изображений Онлайн-клеточной поведения в развивающихся нейроэпителия

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Двухфотонное<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Визуализация дендритных шипиков в мыши Cortex Использование разреженных черепа Подготовка

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Экс естественных изображений послеродовой мозжечка ЗК миграции с помощью конфокальной макроскопии

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Одновременный<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Функциональное тестирование двух сетчатки по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Система электроретинограммы

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Одноклеточных резолюции флуоресценции живут изображений дрозофилы суточного часов в культуре личиночной мозга

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Визуализации ячейки конкретных кальция сигнализации на трехсторонней синапса диафрагмы мыши

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Транспупиллярная двухфотонная визуализация сетчатки мыши In vivo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Кальций Изображения в мыши Нижняя Оливковая

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...